Alagút-nanocsövek irányának meghatározása idegsejtekben és asztrocitákban | sejthalál és betegség

Alagút-nanocsövek irányának meghatározása idegsejtekben és asztrocitákban | sejthalál és betegség

Anonim

témák

  • Az apoptózis
  • asztrocitafunkció
  • Membránkereskedelem

Absztrakt

Az alagút nanocsövek (TNT) egy újonnan felfedezett struktúra, amely részt vesz a sejt-sejt kommunikációban, és különféle típusú sejtekben található meg. Az S100A4-et extracelluláris molekulaként azonosítjuk, és leírjuk annak szerepét a TNT-k növekedési irányának vonzásában. A feltételezett receptorral, a fejlett glikációs végtermék receptorával együtt megmutatjuk részvételüket a TNT iránymutatásában. Eredményeink további mechanizmust javasolnak a TNT-k iránymutatására. A TNT-t iniciáló sejtekben a p53 aktiválja a kaszpáz-3-t, ami az S100A4 hasításhoz és ennek következtében a sejtkoncentráció csökkenéséhez vezet. A sejtes S100A4 csökkenése az S100A4 gradiens kialakulását indukálja az iniciáló sejtek alacsony koncentrációjából a célsejtekben a magas koncentráció felé. Ez az S100A4 koncentráció-gradiens iránymutatást vált ki a TNT-k számára.

Az alagút nanocsövek (TNT-k) vékony membrán alakúak és szabadon lebegő csatornákként vannak leírva. 1, 2 A sejt-sejt kommunikáció új elveként a TNT-ket különféle típusú sejtekben találják, mint például patkányok fehomromocitóma PC12 sejtekben, 1 HEK293 sejtekben, 1, 3 EBV-transzformált humán B-sejtvonalban, 4 egér makrofág J774 sejtben, 4 DU 145 humán prosztatarák sejt, 5 THP-1 monocita, 6 máj HepG2 sejt, 7 TRVb-1 sejt, 7 szarvasmarha emlőmirigy epiteliális sejt, 7 humán monocita eredetű makrofág, 4, 8 patkány asztrocita primer tenyészete, 9 mieloid - vonalú dendritikus sejtek, 6 hematopoietikus törzs és progenitor sejtek 10 és baktériumok. 11 Hasonló sejt-sejt kommunikációs előrejelzéseket citonémákként írtak le Drosophila 12., 13., 14., 15. és MHC II + osztályú sejtek kifejlesztésében in vivo egér szaruhártyában. A TNT-k átvihetik a sejtes organellákat, a felszíni receptorokat, a GPI-vel rögzített fehérjéket és a kalciumáramot. 17 A TNT citoszkeletális komponensei F-aktin és miozin Va. 17., 18. A tenyésztett patkányok hippokampuszos idegsejtjeiben és asztrocitáiban a p53, az epidermális növekedési faktor receptor, az Akt, a foszfoinositid-3-kináz és az mTOR kritikus jelentőségű a TNT megindulásában. 18 TNT mindig fejlődik az inzulált sejtekből a nem inzulált sejtek felé, és ezeket használják a sejtek tartalmának a nem inzulált sejtekbe történő átvitelére. Még nem ismeretes, hogy a TNT-k hogyan találják meg céljukat ezekben az egészséges sejtekben. Itt azonosítottuk az S100A4 kicsi, kalcium-kötő fehérjét, és leírtuk annak szerepét, mint a TNT iránymutatást adó molekulája. A feltételezett receptorát, a fejlett glikációs végtermékek (RAGE) receptorát szintén befolyásolta a TNT útmutatásában.

Eredmények

A TNT átvitte a sejtek tartalmát a sejtek között

A patkányok hippokampuszos asztrocitáit 2 órán át H202-vel kezeljük a TNT fejlődésének indukálására, 18, majd EGFP-vel vagy RFP-vel transzfektáljuk a jobb láthatóság érdekében. A TNT reprezentatív képeinek sorozatát készítettük a letapogató lemezek (z tengely) mozgatásával (1a1 – a3. Ábra). A letapogató lemezek megváltoztatásával egyértelműen megfigyelték a TNT-t (nyíl) (1a1 – a3. Ábra). A TNT szuperfelbontású képe plazmamembrán markerrel azt mutatta, hogy a TNT csőszerű szerkezetű (1b ábra). A többi sejthosszabbítástól eltérően a TNT-k szabadon lebegtek a tenyészetben (Kiegészítő film S1). A z tengely letapogatása azt mutatta, hogy a TNT leválasztott, „áthidaló” szerkezet volt, amely két cella között helyezkedik el (*) (1c. És c. Ábra). Ezt az időhúzásos film is bizonyította (1d. Ábra, S2 kiegészítő film).

Image

A TNT átvitte a sejtek tartalmát a sejtek között. ( a ) A két asztrocita (EGFP-vel transzfektált) TNT-t különböző z-tengelyű lemezeken ( a1 - a3 ) vizsgáltuk. Nyíl: TNT. Méretezőruda: 5 μ m. ( b ) A TNT-re vonatkozó nagy felbontású kép azt mutatta, hogy a TNT csőszerkezet. A sejteket membrán markerrel jelöltük. Méretezőruda: 5 μ m. c ) A TNT z-tengelyének nézete két RFP-vel jelölt asztrocita (*) között, jelezve, hogy a TNT elválasztott, "áthidaló" szerkezet a sejtek között. Méretezőruda: 20 μm . ( c ' ) Nagy kép nagyítás c esetén . Méretezőruda: 10 μm . ( d ) A TNT (nyíl) két asztrocita között leválasztódik az alsó felületről. Méretezőruda: 10 μm . ( e ) A TNT (nyíl) a celluláris anyagokat az egyik asztrocitáról (RFP-vel transzfektált) egy másik asztrocitára (EGFP-vel transzfektált) továbbította. IC, iniciáló cella; TC, Cél cella. Méretezőruda: 50 μm . ( e ' ) Nagyobb kép az E. skálán: 10 μ m. ( f1 – f6 ). A sejtek tartalmát (nyílhegy) az egyik asztrocitáról a másikra egy TNT-n keresztül (nyíl) vittük át idővel. Méretezőruda: 10 μm .

Teljes méretű kép

A kezdeti sejtpopulációk megkülönböztetése érdekében az asztrocitákat először külön tenyésztjük, majd EGFP-vel vagy RFP-vel transzfektáljuk. Az Asztrociták azon csoportját, amelyet H202-vel 2 órán át kezeltünk a TNT fejlődés indukálására, „iniciáló sejteknek” neveztük. Ezeket az iniciáló sejteket ezután tripszinizáltuk, és a sejtek másik csoportjára ('célsejtek') tenyésztettük. A TNT-k (nyíl) általában 24 órán belül alakulnak ki az iniciáló sejtektől a célsejtek felé mutató irányban, amint azt korábban már leírtuk ( 18) (1e ábra). A nagy teljesítményű képen vörös fluoreszcenciát figyeltünk meg a zöld cellában, jelezve, hogy a vörösvérsejt tartalma átvihető a TNT-n keresztül a zöld cellába (1e ábra). Egy másik példában az iniciáló és a célsejtek nem voltak megkülönböztethetők, de megfigyelték a sejtek tartalmának egyik celláról a másikra történő kereskedelmét (1f1 – f6. Ábra, S3 kiegészítő film). Eredményeink azt sugallják, hogy a TNT-k csőszerű, „áthidaló” struktúrák, amelyek a sejtek tartalmát a sejtek között továbbítják.

Az S100A4 vonzza a TNT-ket az asztrocitákban és az idegsejtekben

Két EGFP-vel és RFP-vel jelölt asztrocitapopulációt tenyésztettünk, és a TNT-ket H2O2 kezeléssel indukáltuk RFP-vel transzfektált asztrocitákban. Az egyik célsztrocitát mikroinjektáló staurosporinnal elpusztították. Érdekes módon a kialakult és fejlődő TNT-k iránya megváltozott a közelben lévő másik asztrocitára (kiegészítő S1 ábra), ami arra utal, hogy lehet, hogy a célsejtek elválasztják az irányító molekulát. A tápközeg komponenseit a célsejtektől ioncserélő, hidrofób és méretkizárásos kromatográfia kombinációjával választottuk el. A frakciók mindegyikében lévő fehérjét a gyöngyökre immobilizáltuk, és az asztrocitatenyészetekbe vittük (S2. Ábra). Megvizsgáltuk az egyes frakciókon belüli TNT-irányítási képességüket. A frakciókat, amelyek a TNT-k felé vonzó szerepet képviselik, nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gél elektroforézissel (SDS – PAGE) választottuk el, és a két fő sávot (* és nyíl) elkülönítettük és szekvenálás céljából elküldtük. A MALDI-TOF-MS szekvenálási eredmények a 10-16 kDa (nyíl) molekulatömegű fehérjecsíkot S100A4-ként azonosították (2a. Ábra).

Image

Az S100A4 vonzza a TNT irányát az asztrocitákban. ( a ) Két fehérjecsíkot (* és nyíl) gélszűrés után küldtünk szekvenálásra. Az SDS – PAGE fehérje sávját (nyíl) S100A4-ként azonosítottuk. ( b ) A TNT-k irányának meghatározásához a sejttest közepétől a bevont gyöngy középpontjához egy vonalot húzunk, mint x tengely. Az y tengely merőleges volt x-re. Ezért x és y négy kvadránt jelöltek: I, II, III és IV. Csak azokat a TNT-ket mértük (függetlenül attól, hogy a kiindulási pont hol van) a gyöngyvel ugyanazon az oldalon (pl. A példadiagramban az I. és II. Negyedik, de a III és a IV nem). Ezután egy vonalat húztunk a TNT kezdőpontjától a gyöngyig (a vonal). A TNT végpontjától a vonalig vonalt húztunk (b vonal). Az α szöget mértük az a és b között. Az α 5 ° -ot úgy határozzuk meg, mint 'a gyöngy felé' ( a példadiagramban a bal, nem a jobb oldali panel). ( c ) Az asztrocitákat EGFP-vel transzfektáltuk. A rekombináns S100A4-vel bevont gyöngyök (50 μg / ml) vonzotta a TNT-ket (nyíl). ( c ' ) Nagy kép nagyítás c esetén . ( d ) c fáziskontraszt képe. ( d ′ ) Nagy kép nagyítás a d értéknél . Nyíl: TNT. Méretezőruda: 5 μ m. ( e ) Az asztrocitákat EGFP-vel transzfektáltuk. A PBS-sel bevont gyöngyök nem vonzták a TNT-ket (nyíl). ( e ' ) Nagy nagyítású kép az e számára . ( f ) Az e . fáziskontraszt képe. Méretezőruda ( c - f ): 50 μ m. ( f ' ) Nagy kép az f számára . Nyíl: TNT. Méretezőruda ( c ′ - f ′): 5 μ m. ( g ) A BSA-val bevont gyöngy (fehér kör) (50 μg / ml) nem vonzza a TNT-t (nyíl). Méretezőruda: 50 μm . ( g ' ) Nagy nagyítású kép g esetén . Nyíl: TNT. Méretezőruda: 5 μ m. ( g ″ ) Nagy nagyítású kép g esetén . Szaggatott nyíl: a potenciális TNT kiterjesztése. Méretezőruda: 5 μ m. ( h ) Forrásban denaturált S100A4-vel (50 μg / ml) bevont gyöngy (fehér kör) nem vonzza a TNT-t (nyíl). Méretezőruda: 50 μm . ( h ' ) Magas nagyítású kép h-re . Nyíl: TNT. Méretezőruda: 5 μ m. ( i ) A TNT iránymutatásának összefoglalása különféle körülmények között. Az adatok átlag ± SE értéket képviselnek (minden kísérletben 100 sejt három független készítménynél), ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

Annak igazolására, hogy az S100A4 szerepet játszik a TNT útmutatásában, a rekombináns S100A4-vel bevont gyöngyöket hozzáadtuk az asztrocitikus tenyészethez. Az 50 μg / ml S100A4-vel bevont heparin gyöngyöket a tenyésztőedény egyik sarkába helyezzük. 24 órás inkubálás után megfigyeltük az EGFP-vel transzfektált sejtek TNT növekedésének irányát a gyöngyök felé. Röviden, egy vonalat húztunk a sejttest közepétől a bevont gyöngy közepére, és x tengelyként jelöltük meg. Az y tengely merőleges az x tengelyre, ezért x és y négy négyzetet jelölt meg, amelyeket I, II, III és IV jelöléssel láttak el. Csak azokat a TNT-ket mértük, amelyek a szemcsékkel azonos oldalon helyezkedtek el (nem függnek a kezdési ponttól) (2b. Ábra, pl. A mellékelt diagramban, az I. és II. Negyedik, de a III és a IV nem). Ezután egy vonal húzott a TNT kezdőpontjától a gyöngyig (a vonal). Újabb vonalat húztunk a TNT végpontjától a gyöngyig (b vonal). Az α szöget mértük az a és b között. Az α 5 ° -ot úgy határozzuk meg, mint „a gyöngy felé” (a példadiagramban a bal oldali panel, nem a jobb oldali panel; 2b ábra).

Az S100A4 figyelemre méltóan vonzza a TNT-ket a gyöngyök iránya felé, összehasonlítva a foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS) - vagy a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) bevonatú csoportokkal (2c – g és c′ – g ′). Amikor az S100A4-t 10 percig forralva denaturáltuk, a denaturált S100A4 nem indukálta a TNT-k irányítását (2h és h ′ ábra). Adataink azt mutatják, hogy az S100A4 valóban lehet a TNT-k iránymutatására szolgáló dákómolekulák (2i. Ábra). A HEK293 sejtekben az S100A4 (vörös fluoreszcens sejtek) túlzott expressziója szignifikáns TNT célzást váltott ki (3a, b ábra). Az S100A4-t transzfektáltuk asztrocitákba és HEK293-sejtekbe, mivel mindkettőt célsejtekként használták különböző kísérletekben. A sejt típusától függetlenül, az iniciáló asztrociták mindig kialakultak a TNT-k az S100A4-t túltermelő sejtek felé (3d. Ábra). Ez azt jelzi, hogy az S100A4 elegendő volt a TNT irányának vonzásához. Az S100A4-et expresszáló HEK-sejtek és az asztrociták között létrehozott TNT-kben (3b. És b. Ábra) megfigyelhető volt a celluláris tartalom transzfere (3c1. És c2. Ábra, nyílfejek), ami arra utal, hogy a TNT-k funkcionálisak.

Image

A HEK-ben kifejezett S100A4 vonzza a TNT-t. ( a ) A csak vektorokat (vörös fluoreszcens sejtek) túlexpresszáló HEK293 sejtek nem vonzták az asztrocitákból (zöld fluoreszcens sejtek) kezdődő TNT-t (nyíl). Méretezőruda: 20 μm . ( a ′ ) Nagyított kép a. Méretezőruda: 5 μ m. ( b ) Az S100A4-et túlexpresszáló HEK293 sejtek (vörös fluoreszcens sejtek) vonzotta a TNT-t (nyíl), az asztrocitákból (zöld fluoreszcens sejtek) indulva. Méretezőruda: 20 μm . ( b ′ ) Nagy nagyítású kép b esetén . Méretezőruda: 5 μ m. ( c1 és c2 ) A sejtek tartalmának (nyílfejek) átadását megfigyeltük az idõvel b ′ -ben. Méretezőruda: 5 μ m. ( d ) A iniciáló asztrociták mindig fejlesztettek TNT-ket az S100A4-t túltermelõ sejtek felé, a sejt típusától függetlenül. A, asztrociták; H, HEK293. Az adatok átlag ± SE értéket képviselnek (minden kísérletben 100 sejt három független készítménynél), ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

A RAGE részt vett a TNT iránymutatásában

A TNT képződése során két ellentétes asztrocita között az S100A4-t túltermelő konstrukció mikroinjektálása indukálta a TNT növekedését a célsejtekből az injektált sejtek felé (4b. És b. Ábra). Ezzel szemben az endogén S100A4 leütése az S100A4 siRNS célzott sejtekbe történő mikroinjektálásával gátolta a TNT vonzódását (4e. És e ′ ábra). A célsejtekből származó tenyésztő tápközeget vagy S100A4 ellenanyag, vagy kontroll ellenanyag nyúl szérum IgG abszorbeálja, majd visszavisszük a célsejttenyészetbe. Az így kapott S100A4 antitest-abszorbeált táptalaj szignifikánsan csökkentette a TNT-vonzódást a célsejtekben (4c. Ábra, c '). Összességében ezek az adatok megerősítik, hogy az S100A4 a tápközegben vonzza a TNT irányait (4j ábra).

Image

A RAGE részt vett a TNT útmutatásában. ( a - i ) Az asztrociták (IC, iniciáló sejt, zöld fluoreszcens) és az asztrociták (TC, célsejt, piros fluoreszkáló) és az A100A4 között a célsejtekben és annak feltételezett receptorának RAGE-jában az iniciáló sejtekben a TNT irányításához kritikus jelentőségűek voltak az S100A4 (a célsejtekbe mikroinjektálva, 50 μg / ml), az S100A4 antitest (a célsejtekbe mikroinjektálva, 25 μg / ml), a kontroll IgG (nyúlszérum, a célsejtekbe mikroinjektált, 25 μg) alkalmazásával bizonyítva / ml), S100A4 vagy negatív kontroll (NC) siRNS (transzfektálva a célsejtekbe, 100 ng / μl), RAGE vagy NC siRNS (transzfektálva a kezdő sejtekbe, 100 ng / μl), RAGE antitest (mikroinjektálva a iniciáló sejtek, 25 μg / ml) és heparin (2 μg / ml a tápközegben). Méretezőruda: 50 μm . (a ′ – i ′ ) Nagy nagyítású képek az ai-hoz . Nyíl: TNT. Méretezőruda: 10 μm . ( j és k ) Az adatok összefoglalása azt mutatta, hogy a RAGE részt vesz a TNT iránymutatásában. Az adatok átlag ± SE értéket képviselnek (minden kísérletben 100 sejt három független készítménynél), ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

A RAGE feltételezett receptor az S100A4-re. 19., 20., 21. A két ellentétes asztrocita között képződött TNT-kben a RAGE leütése jelentősen csökkentette a célsejtek felé mutató TNT-k számát (4d, d 'ábra). A RAGE hatásokat akár a RAGE siRNS, akár annak semlegesítő 22 antitestje leütötte a beindító sejtekben. A RAGE antagonista heparin beépítése az iniciáló sejtekbe szintén gátolta a TNT-irányítást (4i. És i '. Ábra). Adataink azt sugallják, hogy a RAGE az iniciáló sejtekben az S100A4 receptorként működik, amelyet a célsejtek kifejezetten szekretálnak a TNT iránymutatásának közvetítésére (4k ábra). Az S100A4 és a RAGE megváltoztatása nem változtatta meg az indukált TNT-k számát (kiegészítő S3 ábra). Ez kizárta annak lehetőségét, hogy az S100A4 és a RAGE befolyásolja a TNT indukció teljes számát.

A RAGE jelenlétét és expressziós mintázatát immunfestéssel határoztuk meg mind a kezdő, mind a célsejtekben. Mind a kezdő, mind a célsejtek (külön-külön tenyésztett és együtt tenyésztett) expresszálták a RAGE-t (5a – d ábra). A iniciáló sejtek többségében a RAGE homogén módon expresszálódott (5a. Ábra), míg a célsejtek egy részében a RAGE perforált mintázatként jelent meg (5b. Ábra). A Western blot azt mutatta, hogy a RAGE mind a kezdő, mind a célsejtekben viszonylag hasonló mennyiségben expresszálódott (5e. Ábra). A kvantitatív RT – PCR azt is kimutatta, hogy a RAGE mRNS szintje mind a kezdő, mind a célsejtekben hasonló mennyiségben volt (5f. Ábra).

Image

A RAGE expresszió mind a iniciáló, mind a cél-asztrocitákban. ( a ) A RAGE expressziót immunfestéssel detektáltuk a iniciáló asztrocitákban. Méretezőruda: 20 μm . ( a ' ) Nagyítású képek a. Méretezőruda: 5 μ m. ( b ) A RAGE expressziót immunfestéssel detektáltuk a cél-asztrocitákban. Méretezőruda: 20 μm . ( b ' ) Nagy nagyítású képek a b értékhez . Méretezőruda: 5 μ m. ( c ) TNT-ket (nyíl) határoztak meg a iniciáló asztrociták (zöld fluoreszcens) és a cél-asztrociták (piros fluoreszcens) között. ( d ) A RAGE expressziót immunfestéssel detektáltuk mindkét sejtpopulációban. Skála ( c és d ): 20 μ m. ( e ) Western blot azt mutatja, hogy a RAGE fehérje szintje hasonló volt mind a kezdő, mind a célsztrocitákban. ( f ) A kvantitatív RT-PCR azt mutatja, hogy a RAGE mRNS szintje hasonló mind a kezdő, mind a célsztrocitákban. Az adatok átlag ± SE (három független készítményben), ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

Kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket, amelyekben nincs endogén RAGE, használtuk a RAGE szerepének megerősítésére a TNT útmutatásában. A nem indukált CHO-sejtek nem képesek TNT-k kifejlesztésére (6a. És b. Ábra). Ha 2 órán át H202 kezeléssel indukálják, a nem transzfektált vad típusú (WT) CHO sejtek TNT-ket fejlesztettek ki, bár nem az S100A4-bevonatú gyöngyök felé (6c. És c. Ábra). Az RAGE-konstrukcióval transzfektált indukált CHO-sejtek TNT-ket fejlesztettek ki az S100A4-vel bevont gyöngyök felé (6d és d 'ábra). Adataink azt sugallják, hogy a RAGE receptorként működhet a iniciáló sejtekben és reagálhat az S100A4 jelátvitelre (6e. Ábra).

Image

A transzfektált RAGE indukálja a TNT útmutatást a CHO-sejtekben. ( a ) Nem transzfektált és nem indukált CHO-sejtekben kevés TNT-t figyeltek meg. A gyöngyöt S100A4-fel bevonjuk. ( b ) A RAGE-transzfektált konstrukciókban és nem indukált CHO-sejtekben kevés TNT-t figyeltek meg. A gyöngyöt S100A4-fel bevonjuk. ( c ) Nem transzfektált és indukált CHO-sejtekben a TNT-ket kimutatták, de nem az S100A4-bevonatú gyöngy felé irányították. Méretezőruda ( a - c ): 50 μ m. ( c ' ) Nagy kép nagyítás c esetén . Nyíl: TNT. Méretezőruda: 20 μm . ( d ) A RAGE-transzfektált konstrukciókban és az indukált CHO-sejtekben a TNT-ket detektáltuk az S100A4-bevonatú gyöngy irányában. Méretezőruda: 50 μm . ( d ′ ) Nagy kép nagyítás a d értéknél . Nyíl: TNT. Méretezőruda: 20 μm . e ) Az adatok mennyiségi összefoglalása. Az adatok átlag ± SE értéket képviselnek (minden kísérletben 100 sejt három független készítménynél), ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

Neuronális aktivitásra volt szükség a TNT-k vonzásához az asztrociták és az idegsejtek között

Az asztrociták és az idegsejtek között elhelyezkedő TNT-ket szintén megvizsgálták. Adataink azt mutatták, hogy az asztrociták közötti TNT-khez hasonlóan az S100A4 és feltételezett receptor RAGE elengedhetetlen a neuronok felé történő TNT-irányításhoz (7a. Ábra, bal oldali panel és b), valamint az idegsejtek és asztrociták közötti irányba (7a. Ábra, jobb oldali panel). Mivel az idegsejtek ingerlékeny sejtek, aztán megvizsgáltuk, hogy az idegsejt aktivitásnak vagy a spontán égetésnek szerepe volt-e a TNT útmutatásában. A Channelrhodopsin-2-t (ChR2) adeno-asszociált vírus transzdukálja neuronokba (AAV, 7c ábra). Mivel a szekretált S100A4 fő forrása az asztrociták a központi idegrendszerben, az idegsejtek nagyon alacsony S100A4, 24 szintet termelnek és szekretálnak, és az asztrocitákból kondicionált tápközeget adtak az idegsejt kultúrához (7c. Ábra). Ezután a H202-stimulált iniciáló asztrocitákat neuronokkal tenyésztjük. Miután ∼ 470 nm-es kék fénnyel aktiváltuk (7c. Ábra), a ChR2 kationcsatornái megnyíltak, hogy Na + beáramlást nyerjenek a neuronokba, és tovább aktiválják a fertőzött idegsejteket (7d ábra). A neuronális aktiváció a TNT vonzerejének figyelemre méltó növekedését váltotta ki, míg az S100A4 siRNS együttes alkalmazása gátolta ezt a növekedést (7e. Ábra). Az idegsejtek aktiválása után a célsejtek tenyésztő tápközegeit az S100A4 antitest abszorbeálta és visszahelyeztük az idegsejttenyészetbe. A TNT irányának vonzására irányuló képesség megfordult a szint szabályozására az ilyen kezeléssel (7e. Ábra), ami arra utal, hogy az idegsejt aktivitás és az S100A4 egyaránt hozzájárultak a TNT irányításához. Hasonló hatásokat figyeltek meg a KCl különböző koncentrációinak alkalmazásával is, amelyek általában növelik az idegrendszeri aktivitást (7f. Ábra). Amikor az NMDA elnyomta az idegrendszeri aktivitást, és a nem-NMDA receptor antagonisták CNQX és MK-801, a TNT vonzereje az idegsejtekben jelentősen csökkent (7g. Ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy mind a neuronális aktivitás, mind az S100A4 kritikus jelentőségű a TNT irányításához. Az asztrociták és az idegsejtek között indukált TNT teljes számát az S100A4, a RAGE, a ChR2 és a CNQX + MK-801 (S3 kiegészítő ábra) nem változtatta meg, ami arra utal, hogy ezek a kezelések nem befolyásolták a TNT indukció teljes számát.

Image

Az S100A4 és az idegsejt aktivitás vonzza a TNT irányát az idegsejtekben. ( a ) Az asztrociták és az idegsejtek (bal oldali panel), valamint az idegsejtek és az asztrociták (a jobb oldali panel) között elhelyezkedő TNT-kben az S100A4 a célsejtekben kritikus volt a TNT irányításához. ( b ) A feltételezett S100A4 receptor RAGE kritikus volt a TNT irányításához. ( c ) A cél idegsejteket adeno vírusba csomagolt ChR2-vel fertőztük, és asztrocitákból származó feltételes táptalajjal tenyésztettük. Az indukált iniciáló asztrocitákkal végzett tenyésztés után az idegsejteket 470 nm-es kék fény által aktiváltuk 10 Hz-en, 2 ms-en 2 órán át. ( d ) A ChR2-fertőzött idegsejt (körözött) idegsejtjeinek rögzítését tapaszbilinccsel rögzítettük. Méretezőruda: 10 μm . Felső panel: Neuronális tüzelés rövid áramerősség-befecskendezésekkel (50 pA, 5 ms, 10 Hz). Alsó panel: A neuronális tüzelést 470 nm-es fény indukálta 10 Hz-en, 2 ms-nál. ( e ) A neuronális aktivitás és az S100A4 kritikus jelentőségű volt a TNT irányításához. ( f ) Különböző KCl-koncentrációkat (1, 5, 10, 25, 50 és 100 mM) alkalmaztunk az idegsejtek aktivitásának fokozására. ( g ) CNQX (10 μM) és MK-801 (10 μM) alkalmazták az idegi aktivitás csökkentésére. Az adatok átlag ± SE értéket képviselnek (minden kísérletben 100 sejt három független készítménynél), ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

A kaszpáz-3 hasította az S100A4-et, amely gradienst indukált a TNT irányításához

Mint sok más, nem klasszikus kiviteli úton forgalmazott fehérjéhez, a 27, 28, az S100A4 egy citoszol fehérje, és ismeretlen mechanizmusok útján választható ki a tápközegbe. 29 Elméletileg, ha mind az iniciáló, mind a célsejtek előállítják és szekretálják az S100A4-et, akkor feltételezhető, hogy hasonló kémiai gradiens alakul ki mindkét sejtcsoport körül. Ha ez igaz, akkor miért növekednek a TNT-k csak a célsejtek felé, nem pedig maga a iniciáló sejt felé vagy egy másik iniciáló sejt felé (8a. Ábra)? Megmértük az S100A4 koncentrációját a citoszolban és a tápközegben mind az iniciáló, mind a célsejtek körül, miközben a tápközeget mikroinjekciós tűvel szűrtük a sejtek különböző csoportjai mellett, negatív levegőprés mellett. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az S100A4 szintek szignifikánsan alacsonyabbak a iniciáló sejtek belsejében és környékén, mint a célsejtek (8b. Ábra). A kondicionált tápközeget úgy gyűjtöttük, hogy a tűt a célsejtek mellé helyezzük, és egyenletesen eloszlatottuk a kovakultúrára. A TNT-k százalékos aránya a célsejtekhez viszonyítva, és maguk az iniciáló sejtek vagy más iniciáló sejtek körülbelül megegyeztek (8b. Ábra, alsó panel). Amikor ezeket a kondicionált tápközegeket az S100A4 antitest abszorbeálta és visszahelyeztük a kókusztenyészetbe, nem volt TNT útmutatás a célsejtek felé (8b. Ábra, alsó panel). A kvantitatív RT – PCR kimutatta, hogy az S100A4 mRNS szintek nagyjából azonosak mind a kezdő, mind a célsejtekben (8c. Ábra). Adataink szerint az S100A4 szignifikánsan alacsonyabb volt a iniciáló sejtekben és azok környékén, mint a célsejtek. Ezért egy viszonylag magas S100A4 kémiai gradiens a célsejtek körül vonzza a TNT-k irányát.

Image

A kaszpáz-3 hasította az S100A4-et az iniciáló sejtekben és indukálta az S100A4 kémiai gradiensének későbbi képződését, amelynek eredményeként megnövekedett koncentrációja a célsejtek körül. ( a ) Ha mind az iniciáló, mind a célsejtek azonos mennyiségű S100A4-et termelnek és szekretálnak, hogyan lehet pontosan, hogy a TNT-k képesek-e megkülönböztetni ezt a két sejttípust, és növekednek az iniciáló sejtektől a célsejtek felé? ( b ) A célsejtek magasabb S100A4 szintet tartalmaznak a citoszolban (bal oldali panel) és a környező közegben (középső panel). Utolsó panel: a kondicionált táptalajt egy mikroinjekciós tűvel összegyűjtötték, negatív levegőnyomással a célsejtek mellé helyezve, és egyenletesen eloszlatva a kókusztenyészetbe. A célsejt (TC), maguk az iniciáló sejtek (Self) vagy más iniciáló sejtek (IC) felé irányított TNT-k százaléka nagyjából megegyezett. Amikor ezeket a kondicionált tápközeget az S100A4 antitest abszorbeálta és visszahelyeztük a kozultúrába, nem volt látható TNT útmutatás a célsejtek felé. c ) A kvantitatív RT – PCR adatok azt mutatták, hogy az iniciáló sejtekben az mRNS-szint körülbelül azonos volt a célsejtekkel. ( d ) Volt egy feltételezett kaszpáz-3 hasítási hely (kiemelve, 68NEVD71) az S100A4 szekvenciában. Az S100A4 (dimer) 3D szerkezete azt mutatta, hogy a kaszpáz-3 hasítás felszabadította az S100A4 teljes N-terminális α- helikális szegmensét. ( e ) A kaszpáz-3 aktivitása szignifikánsan magasabb volt az iniciáló sejtekben, mint a célsejtekben. ( f ) A kaszpáz-3 képes in vitro és in vivo hasítani az S100A4- et . Bal felső rész: a rekombináns S100A4-et in vitro rekombináns kaszpáz-3-dal hasítottuk. A kaszpáz-3 két különálló sávba hasította az S100A4-et körülbelül 7 és 4 kK-nál, amelyeket specifikusan a kaszpáz-3 inhibitor gátolhat, de a kaszpáz-6 inhibitor nem. Az S100A4-D71A mutánst a kaszpáz-3 nem hasította meg. Jobb felső panel: az S100A4 hasítása kaszpáz-3-kal in vitro idővel. Alsó panel: Az S100A4-et in vivo kaszpáz-3 hasította. Az asztrocitákat olyan körülmények között kezeltük, amelyeket korábban már említettünk, és a sejtkivonatokat Western blotok elvégzésére használtuk. siRNA-1 és -2: kaszpáz-3 siRNS-ek. ( g ) Kaszpáz-3 gátlóval (Z-DEVD-fmk, 5 μM) 24 órás kezeléssel az S100A4 szintje körülbelül azonos volt a (bal oldali panel) és a (középső panel) körül a kezdő és célsejtekben. A TNT-k százalékos aránya a célsejt (TC), maguk az iniciáló sejtek (Self) vagy más iniciáló sejtek (IC) felé nagyjából azonos (jobb oldali panel). ( h ) Amikor az idegsejteket fény aktiválta, az S100A4 a környező közegben jelentősen megnőtt. Az adatok átlag ± SE értéket képviselnek (minden egyes kísérletnél 100 sejt három független készítménynél). ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva.

Teljes méretű kép

Ezután felvázoltuk a kérdést, hogy az S100A4 koncentrációja miért magasabb a célsejtek körül, mint a iniciáló sejtek körül. Az S100A4 szekvencia tanulmányozásával találtunk egy potenciális kaszpáz-3 hasítási helyet (68NEVD71) (8d ábra). A feltételezett 3D-s szerkezet azt mutatta, hogy ha az S100A4-et a D71-nél kaszpáz-3 hasítja, akkor az egész N-terminális a- helikális szegmens felszabadul (8d. Ábra). A kaszpáz-3 aktivitási vizsgálatok bebizonyították, hogy szignifikáns mennyiségű kaszpáz-3 aktiváció volt a beindító sejtekben, mint a célsejtek (8e. Ábra). A rekombináns WT S100A4 hasítható rekombináns kaszpáz-3-dal, de nem kaszpáz-6-mal, és két, körülbelül 7 és 4 kb méretű fragmenst állítottak elő (8f. Ábra: mindkét fragmentum azonosítását peptid N-terminális szekvenálásával igazoltuk, adatok nem ábrán látható), amelyet a specifikus kaszpáz-3 inhibitor Z-DEVD-fmk gátolhat. Ezzel szemben az S100A4-D71A mutáns nem hasítható a kaszpáz-3 segítségével (8f ábra).

Kaszpáz-3-gátlóval 24 órán át történő kezelés esetén a sejtes és a szekretált S100A4 szintje nem mutatott különbséget a kezdő és a célsejtek között. Nem volt szignifikáns különbség a TNT-ek számában a célsejtek, maguk az iniciáló sejtek vagy más iniciáló sejtek felé (8g ábra). A fent leírt kísérlet adatai szerint az idegsejt aktivitás nagymértékben javította a TNT útmutatását. Megvizsgáltuk, hogy a neuronális aktivitás növeli-e az S100A4 koncentrációt a cél idegsejtek körül is. A neuronokat ChR2-vel fertőztük, és fény segítségével aktiváltuk. Az S100A4 szintje az aktivált idegsejtek melletti közegben jelentősen magasabb volt, mint a nem aktivált neuronoké (8h ábra). Ez arra utal, hogy a neuronális aktivitás növeli az S100A4 koncentrációját a környező környezetben.

A TNT-k fiziológiai funkciójának további feltárása érdekében a TNT-k összes számát meghatároztuk az asztrocitatenyészetben WT és APP / PS1 egerekből H2O2 jelenlétével vagy anélkül. Adataink azt mutatták, hogy mind indukálatlan (−H 2 O 2 ), mind indukált (+ H 2 O 2 ) körülmények között az APP / PS1 egerek szignifikánsan több TNT-t fejlesztettek ki, mint a WT egerek (9a. Ábra), ami arra utal, hogy a TNT kialakulása stresszhatás lehet. érzékeny gépek. A WT és APP / PS1 egerekből származó asztrocitákat tenyésztettük, és ezekre a sejtekre különféle sértéseket alkalmaztak. Indokolatlan körülmények között spontán fejlődött TNT-ket figyeltünk meg a tenyésztett asztrociták között. A sejthalál százalékát hasonlítottuk össze a TNT bemenetet kapó sejtek és a TNT kapcsolatok nélküli sejtek között. Mind a WT, mind az APP / PS1 egér asztrocitákban a TNT-bemenetet kapó sejtek jobban ellenálltak az STS, az etopozid (Etop), a kainsav (KA), a glutamát (Glu), a H 2 O 2 és a szérum nélkülözés által kiváltott toxicitásnak, mint az előzőekben foglaltak. TNT bemenetek nélkül (9b ábra). Feltételezzük, hogy a sejtek TNT-ket használhatnak a sértetlen sejtes organellák, hasznos anyag vagy energia átvitelére más sejtekbe, amikor apoptózis alatt állnak. 18 Ezért a TNT bemeneteket fogadó cellák nagyobb ellenállással rendelkeznek a sértésekkel szemben. Az adatok azonban azt mutatják, hogy egyes kórokozók, köztük a PrP Sc, a HIV-1, az intracelluláris és az extracelluláris amiloid β (A β ) peptidek „eltérítik” a TNT-ket a sejtükből a sejtekbe történő terjedésükhöz. 18, 30, 31, 32, 33 Jelenlegi adataink megerősítették, hogy a kísérleteinkben megvizsgált egyéb sértésekkel ellentétben az extracelluláris A β peptidek elősegítették a sejtek elpusztulását a TNT bemenetet kapó sejtekben (9b ábra). Ennek további alátámasztására a tenyésztett asztrocitákat mikroinjektáltuk S100A4, anti-S100A4 antitestekkel, IgG kontroll antitestekkel, S100A4 siRNS-sel vagy negatív kontroll siRNS-sel. A spontán TNT-k kifejlesztése után a tenyésztett tápközeget STS-sel vagy extracelluláris Aβ-peptiddel kezeltük. Adataink azt mutatták, hogy az STS-kezelési csoportban az S100A4-vel injektált sejtekben csökkent a sejtelhalás, míg az anti-S100A4 antitesttel vagy S100A4 siRNS-rel injektált sejtekben a sejtek halála fokozódott. A fenti eredményekből (4j ábra) az S100A4-vel injektált sejtek több TNT-bemenetet kaptak, míg az anti-S100A4 vagy S100A4 siRNS-rel injektált sejtek kevés TNT-t kaptak. Adataink azt sugallják, hogy a TNT által megcélzott sejtek életképesebbek voltak az STS sértés esetén (9c. Ábra). Az extracelluláris Aβ peptidkezeléssel azonban a több TNT bemenővel rendelkező sejtek (S100A4 injektált sejtek) több sejthalált mutattak, mint a kontroll, ami arra utal, hogy a TNT célzott sejtek érzékenyebbek az Aβ peptidre (9c ábra).

Image

A sejthalál lehetséges TNT következményei. ( a ) Meghatároztuk a WT és APP / PS1 egerekből származó hippokampusz asztrocitatenyészetben levő TNT-k számát H 2 O 2 -kezeléssel vagy anélkül. ( b ) Mind a WT, mind az APP / PS1 egér asztrocita tenyészetében a TNT bemenetet kapó sejtek jobban ellenálltak az STS, Etop, KA, Glu, H 2 O 2 és a szérumdepriváció (−S) által kiváltott toxicitásnak, mint a TNT nélkül. bemenet. Az extracelluláris Aβ több sejthalált indukált mind a WT, mind az APP / PS1 asztrocitákban. ( c ) A WT egerekből tenyésztett asztrocitákat mikroinjektáltuk S100A4, anti-S100A4 antitestekkel, IgG kontroll antitestekkel, S100A4 siRNS-sel vagy negatív kontroll siRNS-sel. A sejthalált STS vagy extracelluláris Aβ indukálta. Az adatok átlag ± SE ( n = 3). ** P <0, 01 a kontrollcsoportokkal összehasonlítva. ( d ) A stresszt iniciáló sejtekben a p53 aktiváció indukálja a TNT fejlődését és a kaszpáz-3 aktivitást. A kaszpáz-3 hasítja az intracelluláris S100A4-et, tehát az extracelluláris S100A4 viszonylag magas koncentrációjú kémiai gradienst indukál a célsejtek körül. A TNT-k követhetik ezt a gradienst, hogy megtalálják a célsejteket.

Teljes méretű kép

Vita

Ez a konkrét vizsgálat az S100A4-et extracelluláris vonzó molekulaként azonosította, amelynek szerepe van a TNT iránymutatásában. Az S100A4 egy kalciumot kötő S100 proteincsaládba tartozik, amelynek legalább 21 tagja van. Az S100A4 a citoplazmában, a magban és az extracelluláris térben helyezkedik el. 29 Az S100A4-et széles körben megvizsgálták az áttétekben betöltött szerepének szempontjából, az angiogenezisben, az invázióban és a sejtmobilitásban való szerepe miatt. Az N-terminálison szignálpeptid nélküli celluláris proteinként az S100A4 egy nem-klasszikus szekréciós útvonal útján található. Az extracelluláris S100A4 jelenléte számos rendszerben bizonyított. 19., 29. Bár az extracelluláris fehérjék nagy részét az endoplazmatikus retikulum (ER) / Golgi-függő szekréciós útvonal választja ki, egyre több adat mutatta, hogy egy nem klasszikusan szekretált fehérjék, mint például az S100A4, egy ER / Golgi-független keresztül exportálódnak. útvonal. 27., 28. Számos mechanizmust javasoltak egy ilyen nem klasszikus szekréciós útvonalhoz, ideértve a lizoszóma szekréciót, a 34 közvetlen fehérjeport, a 35 multivezáris testfelszabadulást ( 36) és a plazmamembrános vérzést. 37 Az S100A4 extracelluláris kivitelének módja azonban továbbra sem tisztázott, ezért tovább kell vizsgálni. Az S100A4 szekréciója fokozódik az asztrocitákban stressz, például tumor migráció, perifériás ideg vagy háti gyökér sérülés esetén. 38, 39, 40

Adataink azt sugallják, hogy az asztrociták és az asztrociták közötti TNT esetében az S100A4 elegendő a TNT célzásához. Az asztrociták és az idegsejtek között kialakult TNT esetében azonban az S100A4 jelenléte és az idegsejtek aktiválása egyaránt szükséges a TNT célzásához. Izgatható sejtekként a neuronok égetésük révén megkülönböztetik magukat a többi sejttől. Az idegsejtek integritása érzékenyebb, mint a morfológiai integritás, amikor az idegsejtek stressz alatt állnak vagy öregedés alatt állnak. 41 Ezért ha a TNT-k a sejtek tartalmát a sérült sejtekről az egészséges sejtekre továbbítják, amint azt feltételeztük, 18 TNT-nek sikeresen meg kell találnia az egészséges célsejteket a kapcsolatok felépítéséhez. Mind az S100A4, mind az idegsejt-aktivitás követelménye lehet a TNT-k számára, hogy megkülönböztessék az egészséges idegsejteket másoktól.

A RAGE-t feltételezett sejtfelszíni receptornak nevezik az S100A4-hez. Adataink megerősítik, hogy az S100A4 a TNT útmutatását közvetíti a RAGE-n keresztül a kezdő cellákban. Itt javasoljuk, hogy az extracelluláris S100A4 valóban vonzza a TNT irányát, és így szerepet játszik a TNT irányításában. A stresszes iniciáló sejtekben a p53 aktiváció indukálja a TNT fejlődését 18, valamint a kaszpáz-3 aktivitást. A Caspase-3 hasítja az intracelluláris S100A4-et, ezért kémiai gradienst hoz létre a célsejtek körül az S100A4 viszonylag magas koncentrációjának indukálásával. A TNT-k ezt követően ezt a gradienst követik, hogy megtalálják a célsejteket (9d ábra). Széles körben elfogadott tény, hogy a kaszpáz-3 aktiválása kritikus jelentőségű sok sejt apoptózisához és sejthalálához. A legfrissebb bizonyítékok azonban arra utalnak, hogy a kaszpáz-3 jelátvitel szintén fontos az idegrendszer fejlődésében és differenciálódásában. 44 Ebben a konkrét vizsgálatban nem határoztak meg, hogy a kaszpáz-3 aktiválása indukálja-e a sejthalált az iniciáló sejtekben, mielőtt a TNT-ket célsejtekkel készítik. Érdekes lesz feltárni a kérdésre adott választ, ha meghatározza a TNT szerepét a sejthalálban és a neurodegenerációban.

Az in vivo bizonyítékokat, amelyek hasonló sejt-sejt kommunikációs előrejelzéseket mutatnak, citonnemekként írták le Drosophila képzeletbeli korongok 12, 13, 14, 15 és MHC II + + osztályú sejtek kifejlesztésében egér szaruhártyájában. A TNT valóban fontos szerepet játszhat a neurodegeneratív betegségekben. Az Alzheimer-kór (AD) esetében feltételezik, hogy mind az Aβ, mind a tau egyértelműen befolyásolják a betegség fejlődését és progresszióját. Az A β mikroinjektálása iniciáló sejtekbe képes indukálni a célsejtek sejthalálát. 18 Ennek egyik lehetséges magyarázata az, hogy A β felhasználhatja a TNT-ket „expressziós módszerként” a környező sejtekbe történő terjedéshez. Ezt támasztja alá az a tény, hogy a TNT-kben az A β négyszer gyorsabb sebességgel halad, mint ER, Golgi, endoszóma és mitokondriumok. 18 Ezenkívül a tauban a közelmúltban terjedt az agyszövetekben a szinapszisok korai AD-jével. 46., 47. Lehetséges, hogy a tau-ot közvetlenül átviszik a két sejt között elhelyezkedő TNT-k, és neurodegenerációt indukálnak. Nagyon fontos lenne a TNT-k azonosítása a különféle fiziológiás és patológiás szövetekben, ami elősegíti a TNT-k funkcionális szerepének megértését és a potenciális terápia kidolgozását a TNT fejlődésének következtetésein, célzásán és a TNT-k belső sejtanyag-kereskedelme alapján.

Kiegészítő információk

PDF fájlok

  1. 1.

    Kiegészítő S1-S3 ábrák

Videók

  1. 1.

    Kiegészítő film 1

  2. 2.

    2. kiegészítő film

  3. 3.

    Kiegészítő film 3

Word dokumentumok

  1. 1.

    Kiegészítő legendák

Szójegyzék

A β

β- amiloid

HIRDETÉS

Alzheimer kór

ANOVA

varianciaanalízis

BSA

szarvasmarha-szérumalbumin

CHO

Kínai hörcsög petefészek

CHR2

channelrhodopsin-2

DMEM

Dulbecco módosított Eagle közege

ER

endoplazmatikus retikulum

Etop

etopozid

FBS

magzati szarvasmarha szérum

Glu

glutamát

HRP

torma-peroxidáz

KA

kaininsav

PBS

foszfáttal pufferolt sóoldat

SDS-PAGE

nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gél elektroforézis

DÜH

fejlett glikációs végtermék receptor

TBS

Trisz-pufferolt sóoldat

TBS-T

TBS Tween-20-dal

TNT

alagút nanocső

TUNEL

terminális deoxinukleotidil-transzferáz-biotin dUTP nick-end jelölés

WT

vad típus

Szerző hozzájárulások

Az XS és YW az összes kísérletet elvégezte, kivéve, ha másképp jelezték, és elemezte az adatokat. A JZ és a JT javítás-rögzítő kísérleteket végzett. Az X-JW előállította az S100A4 D71A mutánst. Az X-DS felügyelte az S100A4 mutáns kísérletet. LW és YZ megfogalmazta a tanulmányt, elemzéseket végzett és elkészítette a kéziratot.

Kiegészítő információk kísérik a sejthalál és -betegségek weboldaláról szóló dokumentumot (//www.nature.com/cddis)