A kettős ko egerek károsodott cns fejlődésének és immunhiányának a paxx és xlf kölcsönhatása | sejthalál és differenciálódás

A kettős ko egerek károsodott cns fejlődésének és immunhiányának a paxx és xlf kölcsönhatása | sejthalál és differenciálódás

Anonim

témák

  • Genetikai kölcsönhatás
  • A limfociták

Absztrakt

A kettős szálú DNS-törések (DNAdsb) helyreállítása nem homológ végcsatlakozással (NHEJ) a központi idegrendszer és az adaptív immunrendszer megfelelő fejlődésének előfeltétele. Mégis, az Xlf vagy PAXX funkciókkal nem rendelkező egerek életképesek és nagyon enyhe immunfenotípusokkal vannak jelen, bár limfoid sejtjeik érzékenyek az ionizáló sugárzásra, igazolva ezen faktorok szerepét az NHEJ-ben. Ezzel szemben itt megmutatjuk, hogy az Xlf és a PAXX esetében is hibás egerek embrionálisan letálisak, mivel a posztmitotikus neuronok hatalmas apoptózise következik be, ami egy olyan helyzetre emlékeztet, amely az XRCC4 vagy a DNS Ligase IV KO körülményekre emlékeztet. Az adaptív immunrendszer fejlődését az Xlf - / - PAXX - / - E18.5 embriókban súlyosan befolyásolja a B- és T-sejtek érésének blokkolása az IgH és a TCR β génátrendeződés szakaszában. Ez a káros fenotípus kiemeli az Xlf és a PAXX közötti funkcionális kapcsolatot, amely kritikus jelentőségű az NHEJ-függő mechanizmusok megvalósításához az egér fejlesztése során.

Az összes élő szervezet élettartama során számos DNS-káros hatásnak van kitéve, akár külső támadás, akár endogén fiziológiai folyamatok eredményeként. 1 A fiziológiai DNSdsb endogén forrásai között szerepel az immunoglobulin (Ig) és a TCR gének szomatikus átrendeződése a B és T limfocitákban, az adaptív immunrendszer diverzifikációja során a V (D) J rekombináció révén. 2 kettős szálú DNS-törést (DNAdsb) tekintünk a legtoxikusabb lézióknak. A DNSdsb-kat két fő mechanizmus segítségével javítják: a homológ rekombináció (HR) a ciklikus sejtekben, amikor nővér kromatid áll rendelkezésre DNS-javító templátként, és a nem-homológ vég-összekapcsolódás (NHEJ) a sejtciklus minden fázisában.

Az NHEJ a DNS-végek egyszerű religálásával jár, anélkül, hogy javítósablonra lenne szükség. 3 Röviden: az NHEJ hét alapvető tényezőből áll, amelyek a Ku70 / 80 / DNS-PKcs (DNS-függő protein-kináz katalitikus alegység) komplexet tartalmazzák, amely felismeri és védi a megtört DNS-végeket, az Artemis endo / exonukleázt, amely részt vesz, amikor Szükség van a DNS-végek és az XRCC4 / DNA-Ligase IV / Xlf komplex feldolgozására, amely végül újra lezárja a DNS-törést. Az NHEJ készülék kritikus funkcióját a magasabb eukarióta fejlõdés különféle szempontjain széles körben észlelték számos állat- és emberi kóros állapotban. Emblematikus példákként az XRCC4 vagy a DNS-ligáz IV funkciójának elvesztése embrionális lethalitást eredményez a 4., 5. egereknél , és az Artemis vagy a DNS-PKcs mutációi súlyos kombinált immunhiányos körülményeket eredményeznek mind férfiakban, mind egerekben az abortált V (D) miatt. J rekombináció. 6 Ezen túlmenően az NHEJ hibái genetikai instabilitást és különféle rákos megbetegedések hajlandóságát eredményezik, nevezetesen a leukémiát és a limfómákat. 7

Nemrégiben három laboratórium azonosított egy új DNS-javító tényezőt, a PAXX-t (PARlog XRCC4 és Xlf, más néven C9orf142 vagy XLS), bioinformatikai és biokémiai megközelítések alapján. 8., 9., 10. A PAXX az XRCC4 szupercsaládhoz tartozik, és szerkezeti hasonlóságokat mutat mind az XRCC4, mind az Xlf-rel. A PAXX-t a DNSdsb-hez toborozzák, és a Ku / DNAPK komplex fizikai interakciója, nevezetesen a Ku70-rel való interakciója révén. Meglepő módon az NHEJ faktor esetében a PAXX hiánya szisztematikusan nem eredményezi az ionizáló sugárzással szembeni fokozott érzékenységet, és a különféle DNS-helyreállítási vizsgálatok eredményei erősen vitatottak, a kísérleti beállításoktól függően. 8., 9., 10., 12., 13., 14., 15. Ez bizonyos körülmények között a PAXX hiány lehetséges funkcionális kiegészítésére utalt.

Annak érdekében, hogy elemezzük a PAXX szerepét az egér fejlődésében in vivo, és azonosítsuk a lehetséges redundáns funkciót egy másik DNS-javító faktorral, CRISPR / Cas9 PAXX mutáns egérvonalakat készítettünk. Bár a PAXX kizárólagos inaktiválása nem eredményezett túlnyomó fenotípust, a PAXX és az Xlf egyidejű törlése súlyos következményekkel járt, embrionális halálozáshoz és a V (D) J rekombináció leállításához az embriókban. Összességében ezek az eredmények összhangban állnak azzal, hogy a PAXX jóhiszemű NHEJ faktor, és rámutat a PAXX és az Xlf közötti kritikus funkcionális kölcsönhatásra az egér fejlesztése során.

Eredmények és vita

PAXX KO egerek generálása

A PAXX KO egereket CRISPR / Cas9 alkalmazásával állítottuk elő. Két irányító RNS célszekvenciát választottunk ki az egér PAXX génjének 1. exonjában (PAXX1) és 2. exonjában (PAXX2) (1a. Ábra és kiegészítő S1A. Ábra). A két gRNS hatékonyságát a Bsr BI és Sac I restrikciós helyek eltűnésével értékeltük, amikor az MEF-eket transzfektáltuk a gRNS-eket és Cas9-et expresszáló pX330 vektorral (S1B. Ábra). A mutáns egérvonalak előállításához a zigótákat mikroinjektáltuk pX330-tal Mashiko et al. Tizenhárom és öt F0 egeret nyertünk PAXX1 és PAXX2 esetén. A farok DNS-t PCR-rel és restrikciós emésztéssel (PCR-RE) elemeztük, hogy azonosítsunk négy PAXX1 és két PAXX2 F0 mutáns egeret, amelyek az emésztetlen DNS egyértelmű visszatartását mutatják a háttér felett (kiegészítő S1C ábra). Az F0 egereket a C57Bl / 6-ra kereszteztük, hogy elkülönítsük a CRISPR / Cas9 által generált mutáns alléleket. Két mutációs allél közvetlen DNS-szekvenálásával két F0-ból származó F1 egeret választottunk, a # 2-t PAXX1-re és a # 14-et. A CRISPR / Cas9 mutagenezis mindkét esetben 8 bp méretű deléciót és azt követő framehift eredményt eredményezett (1a. Ábra). Mindegyik sort hatszor kereszteztük a C57Bl / 6-on a 2. kromoszómán kívüli esetleges események elkülönítésére. A homozigóta mutáns egereket PAXX1 +/– vagy PAXX2 +/– heterozigóta alapítók keresztezésével nyertük. A homozigóta egerek életképesek voltak, és Mendel frekvencián termelték őket, kizárva a PAXX hiány fő hatását az embriógenezis során. A CRISPR / Cas9 által előállított PAXX mutáns allél funkciójának elvesztését Western blot-módszerrel derítettük fel, a thymus, lép és a PAXX2 egér vonal MEF fehérjekivonatainak felhasználásával. Amint az 1b. Ábrán látható, a PAXX fehérje expressziója nem volt kimutatható PAXX2 - / - egerekben, szemben a vad típusú alomtársakkal. Megállapítottuk, hogy a CRISPR / Cas9 mutagenezis teljes PAXX funkcióvesztést eredményezett.

Image

PAXX KO egerek tervezése és immunfenotípusának meghatározása. ( a ) A PAXX gén CRISPR / Cas9 mutációinak létrehozására használt gRNS tervezése. A mutagenezis szkrínelésére használt Bsr BI és Sac I restrikciós enzim helyeket aláhúzzuk . A két vonal, a PAXX1 és a PAXX2, 8 bp-os deléciót tartalmaz, ami kereteltolódást eredményez. ( b ) Western blot analízis, amely megerősíti a PAXX funkciók elvesztését PAXX2 mutáns egerekben, a hiányzó fehérje mellett a csecsemőmirigyben, lépben és MEF-ben. c ) A wt immunfenotípusa ( N = 11), PAXX1 ( N = 4), PAXX2 ( N = 12) és Xlf ( N = 7) egereknél. A timociták és splenociták FACS-ábrázolása és az abszolút számok ábrázolása. ( d ) A TCR- α repertoárjának szemléltetett Circos-plot ábrázolása a C57Bl / 6, Xlf és PAXX2 egerek timocitáiban. Mindegyik akkordvonal egy TCAV és egy TRAJ szegmens közötti asszociációt jelöl, amelyet a TCR α transzkripciós szekvenálás határoz meg. A TCR α TRAV gén felhasználásának mennyiségi meghatározása C57Bl / 6, Xlf és PAXX2 egerekben. A TCR α repertoár meghatározását kétszer megismételjük, összesen hat PAXX2 KO, öt C57Bl / 6 és hat Xlf KO egér alkalmazásával. A statisztikai elemzéseket Mann – Whitney nem-paraméteres t- teszttel végeztük Prism v6 alkalmazásával (*** P <0, 001).

Teljes méretű kép

Az immunrendszer normális fejlődése PAXX KO egerekben

A DNS Damage Response (DDR) mechanizmusok, különösen az NHEJ út megfelelő képessége kritikus a B és T limfociták megfelelő fejlődéséhez, mivel a DNSdsb generálódik az Ig és a TCR gének szomatikus DNS átrendeződése során. Ennek ellenére az Xlf-hiány nem befolyásolja súlyosan a V (D) J rekombinációs folyamatot és az Xlf-hiányos egereket, akik immunrendszerük nagyon enyhe sérülést mutat, elsősorban a limfocitaszám enyhe csökkentével és a timociták számának növekedésével apoptózist. 17., 18. ábra Minőségi szempontból ez a TCR α- repertoár torzulásához vezet, és a távoli TRAV és TRAJ génszegmensek alulreprezentáltak. 17 Az immunrendszer elemzése mind a PAXX1, mind a PAXX2 KO egerekben a Tymus sejtek általános normális fejlõdését támasztotta alá, annak ellenére, hogy a timociták száma statisztikailag szignifikánsan csökkent az Xlf egereknél megfigyelt tartományban (1c ábra). Az érett B- és T-sejtek száma a lépben összehasonlítható volt a PAXX egerek és a WT alomtársak között. Ez általában megegyezik a korábban leírt PAXX mutáns egerekkel. A 12., 15. TCR- α repertoár elemzése az 5 'RACE RT-PCR-en keresztül és a következő generációs szekvenálás során egy jól diverzifikált TCR α- repertoárt mutatott a PAXX egerekben, összehasonlítva a WT és az Xlf állatokkal (1d ábra). Az Xlf timocitákban a távoli V α J α felhasználás jelentős csökkenésével ellentétben, amint azt korábban már leírtuk, a PAXX egerek 17 timocitája nem mutatott semmiféle torzítást ezen TCR α génszegmensek reprezentációjában. Ezen megfigyelések alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a PAXX funkcióvesztése nincs káros hatással a V (D) J rekombinációs folyamatra és / vagy a timociták általános életképességére.

DNSdsb javítási hiba PAXX KO egerekben

Tekintettel arra, hogy homológiája mind az XRCC4, mind az Xlf, úgy gondolják, hogy a PAXX beavatkozik a DNS helyreállítása során az NHEJ révén. A vérből vagy lépből izolált 8, 9, 10 T-limfociták elsősorban nem ciklusos nyugalmi sejtek, amelyek eredményeként az NHEJ-t felhasználják a DNSdsb megbirkózásához, ha a HR csak ciklikus sejtekben működik. Felállítottuk a PAXX szerepének elemzését az NHEJ során a T-sejt lép-IR érzékenységének felmérésével (2a. Ábra). Az ex vivo izolált pihenő lép érett T-sejteket különféle infravörös dózisoknak vetjük alá (0–4 Gy). Az IR-indukálta DNSdsb helyreállításának lehetővé tétele után a 4 órát a sejteket 4 napig inkubáltuk anti-CD3 / anti-CD28-val bevont gyöngyökkel, ami aktiválja és indukálja a T-limfociták erős proliferációs válaszát, amelyet könnyen meg lehet határozni a a CellTrace festék hígítása a sejtosztódás után. Ezt a leolvasást átlagként használtuk a szaporodás relatív indexének, és így a sejtek túlélésének IR-t követő pontozására. Ennek a protokollnak az alkalmazásával az Xlf egerek T-sejtjei rendkívüli IR érzékenységet mutattak a WT-hez képest (2a. Ábra), és a sejtek túlélésének csökkenése már az első Gy adagban volt, amint az Xlf hiány esetén várható. A PAXX-hiányos T-limfociták szintén feltűnően sugárérzékenyek voltak, bár kisebb mértékben, mint az Xlf-hiányos T-sejtek. Ezzel szemben a PAXX mutánsokból származó egér embrionális fibroblasztok (MEF) rezisztensek voltak mind az IR, mind a DNSdsb indukáló Phleomycin ellen, a sejtek túlélése hasonló volt a WT MEF-ekéhez (2b ábra), míg az MEF nem megfelelő XRCC4, DNS-Ligase IV vagy Xlf esetén. a vártnál nagyon érzékenyek voltak. Ez összhangban áll a PAXX - / - MEF-ek korábban megfigyelt enyhe érzékenységével az IR 15-re, de ellentmond a Balmus et al. 12 A PAXX három különféle csoport általi azonosítása óta annak a DDR-beli befolyásolása, amelyet a genotoxikus gyógyszerekre vagy IR-re való érzékenység alapján ítéltek meg, nagyon ellentmondásos volt, az in vitro elemzett sejtvonalatól, a kísérleti körülményektől és a DNS-károsodást okozhat. 8., 9., 10. Érdekes módon az aszinkron PAXX-hibás CH12 B-sejtvonalak vagy a v-Abl-transzformált Pro-B-sejtvonalak nem mutatnak semmilyen infravörös érzékenységet, mint wt társaik, mint amit a MEF-ekben találtak, és az egyidejű A PAXX és az Xlf hiány nem rontja az érzékenységet, amelyet csak az Xlf mutáció okozott ezekben a ciklikus sejtekben. 13 Ezzel szemben a PAXX - / - / Xlf - / - v-Abl pro-B sejtek szinkronizálása a sejtciklus G1 fázisába vagy STI-571-gyel (v-Abl kináz inhibitor), vagy PD033991-rel (CDK4 / 6 inhibitor) ) az IR szélsőséges érzékenységét eredményezi, amely jóval meghaladja az Xlf - / - egyes mutánsok érzékenységét ugyanolyan körülmények között, és a PAXX egyedülálló szerepére hivatkozik a klasszikus NHEJ-ben, amikor a DNS károsodása történik a G1-ben, tehát funkcionális HR hiányában. A PAXX - / - egerekből nyugvó, ex vivo tisztított T-limfociták IR érzékenységének megfigyelése egyetért azzal, hogy a PAXX specifikus szerepet játszik a C-NHEJ során.

Image

DNS-javítási hiba PAXX KO egerekben. a ) Sugárérzékenységi vizsgálat érett lép-T limfocitákon. A FACS elemzéshez a megduplázódott populációkat kapcsolatokban kaptuk meg, amelyeket a CellTrace jel hígítása és a Roederer szerint kiszámított proliferációs index határoz meg. Az egyes mintákhoz a relatív proliferációs mutatókat ábrázoltuk az IR hiányában történő proliferációnak megfelelően, és a sugárérzékenységi szint meghatározására használtuk. A kísérletet kétszer megismételjük, genotípusonként két egérrel, minden alkalommal. ( b ) Phleomycin és IR érzékenység SV40-transzformált MEF-eken. Az XRCC4, a DNS-Ligase IV és az Xlf KO egerekből származó MEF-eket alkalmazták sugárérzékeny kontrollokként. A relatív növekedési indexeket úgy számítottuk ki, hogy a kezelt sejtek és a nem kezelt sejtek konfluenciáját összehasonlítottuk a tenyésztés során a valós idejű incucyták ellenőrzésével (lásd Anyagok és módszerek). Ezt a kísérletet háromszor megismételjük

Teljes méretű kép

A PAXX-Xlf kölcsönhatás az idegfejlődés során

Ezt követően felméri a PAXX és az Xlf közötti lehetséges funkcionális kapcsolatot a DNS károsodási válasz (DDR) során, kétszer hiányos egerek generálásával, akár a PAXX - / - Xlf +/−, akár a PAXX +/− Xlf - / - állatok keresztezésével. Semmilyen esetben nem szereztünk PAXX - / - / Xlf - / - egereken összesen 176 újszülöttnél (44 PAXX1 és 132 PAXX2), amelyeket különféle genotípus-kombinációk keresztezéséből nyertünk, amelyekre várhatóan kb. 31 (11 PAXX1 és 20 PAXX2) hordozza a PAXX - / - / Xlf - / - DKO genotípust, azzal érvelve, hogy a két faktor együttes inaktivációja embrionális halálozást idéz elő (3a. ábra), amint azt korábban két különféle vizsgálatban megfigyelték. Az embrionális lethalitást mind a PAXX1, mind a PAXX2 mutáns vonalakkal megfigyeltük, kizárva a fenotípusért felelős célpont nélküli hatást. Az élő DKO-embriókat könnyen le lehet szerezni E18.5 egerekben lefelé (3b. Ábra), a DKO-állatok késői embrionális halálozására hivatkozva, hasonlóan az XRCC4 és a DNS Ligase IV KO egerek korábban ismertetett késői embrionális lethalitásához. 4, 5 Ennek ellenére az E18.5-es embriók általában kisebbek voltak, mint heterozigóta alomtársak (3b. Ábra), ami igazolja abnormális fejlõdésüket. A PAXX / Xlf DKO embriók halálossága volt a PAXX és az Xlf közötti funkcionális kölcsönhatás első bizonyítéka, amelynek együttes inaktiválása jelentős életképességi fenotípust eredményez, amikor mindkét egyes mutáns nem bizonyítja fejlődési hibát (ez a tanulmány és Vera és munkatársai, 17. ). Az XRCC4 és a DNS-Ligase IV KO egerekben az embrionális lethalitást a post-mitotikus neuronok hatalmas apoptózise okozza. 4, 5 Hasonlóképpen, számos pyknotikus mag és a hasított kaszpáz 3 (CC3) immunfesték jelenléte súlyos neuronális apoptózist tárt fel az Xlf - / - PAXX - / - embriók agyában (3c – e ábra, kiegészítő S3 ábra). ahogy korábban beszámolták. 12, 15 Ez ellentétben állt az Xlf - / - embriók agyában lévő szűkös apoptotikus sejtekkel és a PAXX - / - embriók hiányával (3c – e ábra és az S3A kiegészítő ábra). A hatalmas neuronális apoptózis megfigyelése a PAXX - / - Xlf - / - DKO-ban a kereszteződésekben alkalmazott PAXX1 vagy PAXX2 mutáns típusától függetlenül ismét kizárta a CRISPR / Cas9 célzott hatását, amely felelős e fenotípusért. Noha az apoptózist azokban a régiókban detektálták, ahol a neurális progenitorok szaporodnak (azaz a kamrai (VZ) és a szubventrikuláris zónákban (SVZ) körülveszik az oldalsó félgömböket), a poszt mitotikus neuronokat tartalmazó régiókban ez volt a legszembetűnőbb. Valójában, összhangban a különböző agyi struktúrák neuronális termelésének kinetikájával, az apoptózis elsősorban a ventrális telencephalonban található az E12.5-nél (3a ábra) és a dorsalis telencephalonban az E15, 5-nél (3b. És c. Ábra és az S3B. Kiegészítő ábra). .

Image

Embrionális letalitás és masszív neuronális apoptózis PAXX - / - Xlf - / - embriókban. a ) A PAXX - / - Xlf - / - DKO egerek káros fejlődése. A PAXX1 vagy a PAXX2 és az Xlf keresztek különböző kombinációiból (44 és 132 kölyök) nem született DKO egerek. A megfigyelt (obs.) És a várható (Exp.) Genotípus eloszlások közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját χ 2- teszttel értékeljük. b ) A PAXX - / - Xlf - / - embriók túlélése E18, 5-ig. Fénykép, amely a PAXX - / - Xlf - / - E18.5 embriók csökkent méretét mutatja. c) és d ) a wt. agyféltekének koronális szakaszai . , PAXX - / -, Xlf - / - és PAXX - / - Xlf - / - embriók, amelyeket E12.5 ( c ) és E15.5 ( d ) pontnál gyűjtöttünk és 4'-6-diammidino-2-fenilindollal ( DAPI; szürke) és CC3 (piros). Az erek narancssárga színűek. Méretezőrudak: 200 μm. ( c ) Az E12.5-nél a PAXX - / - Xlf - / - embriókban az apoptózist nagymértékben detektálják a ganglionos kimenetelek (1, 2) közbenső zónáiban (IZ), amelyek a striatum és a globus pallidus számára újonnan létrehozott neuronokat tartalmaznak. ( d ) Az E15.5-nél a PAXX - / - Xlf - / - embriókban az apoptózis uralkodik az IZ-ben és a hátsó telencephalon kortikális lemezein (CP-jén), amelyek a neocortex újonnan létrehozott poszt mitotikus neuronjait (3) és a hippokampusz (4). ( e ) Az oszlopdiagramon a hasított-kaszpáz-3-pozitív sejtek kortikális szeleteinkénti átlagos száma ± SD, amelyet a kamrai zónában (VZ), szubventrikuláris zónában (SVZ), IZ-ben és a neocortex neocortex CP-jében észleltek . , PAXX - / -, Xlf - / - és PAXX - / - Xlf - / - embriók E12.5 és E15.5 ponton. Az adatokat csoportonként legalább három embrióból nyerték. A csillagok jelzik a statisztikai szignifikanciát a wt kontrollokhoz képest. ** P ≤0, 01, *** P ≤0.001; Mann – Whitney teszt

Teljes méretű kép

A PAXX-Xlf kölcsönhatás a limfoid fejlődése során

A PAXX és az Xlf egyidejű deléciójának a központi idegrendszer fejlődésére gyakorolt ​​jelentős hatása, amely késői embrionális lethalitást eredményez, erősen emlékeztet mind az XRCC4, mind a DNS Ligase IV hiányos állapotokra, amelyekben az NHEJ súlyosan befolyásolja. 4, 5 Mivel az immunrendszer fejlődésének egyik fő hibája ezen NHEJ-hiányos egérmodellek egyik jellemző tulajdonsága is, arra törekedtünk, hogy ezt a kérdést kvalitatív és kvantitatív módon elemezzük az Xlf - / - PAXX - / - DKO embriókban. A TCR gén átrendeződése az E13 körül kezdődik, és a timuszok könnyen visszaszerzésre kerülnek az E18.5-nél, az ezen elemzéshez kiválasztott vemhesség napján. Az E18.5-nél a tömegű egerek timuszai átlagosan 1, 71 × 106 timocitát tartalmaztak (4a. És b. Ábra). Ezt a számot nem befolyásolta a PAXX önmagában történő törlése (1, 84x106), de a kettős körül szignifikánsan csökkent. az Xlf KO (0, 9x106, P <0, 0001) összefüggései, amint azt korábban a 6-8 hetes mutáns egerek kacsmájában találták meg. 17, 18 Feltűnő módon az Xlf - / - PAXX - / - embriók a timocita szám tízszeres csökkenését mutatták (1, 7x105, P <0, 0001). A timociták teljes számának ezt a csökkenését elsősorban a CD4 + CD8 + kettős pozitív (DP) timociták veszteségének tudható be az Xlf - / - PAXX - / - egerekben, összehasonlítva a wt egerekkel (7, 40 × 10 3 és 7, 75 × 10). 5, P <0, 0001), rendellenes érési folyamatra hivatkozva. A DP4 érés előtti CD4 – CD8 – kettős negatív (DN) timociták tovább oszthatók különböző populációkba a CD44, CD25 és CD28 felületi markerek differenciált expressziója alapján. 20 Különösen a CD44-CD25 + CD28 + (DN3b) frakció képviseli azokat a timocitákat, amelyek β- szelekción mentek keresztül, amikor TCR- β lókuszuk sikeres átrendeződött. Később DN3c-re, DN4a-ra és DN4b-re, végül DP-re lépnek, ahogy azt a 4a. Ábra szemlélteti. Ezen archepikus timocitapopulációk elemzése az Xlf - / - PAXX - / - DKO E18.5 embriókban egy fő blokkot tárt fel a DN3a DN3b átmeneten keresztül (4a. És b. Ábra), ami a timociták számának jelentős csökkenését eredményezi a DN3b stádiumtól kezdve. tovább, összehasonlítva a tömegű egerekkel (1, 3x104 és 8, 3x104, P <0, 0001). Ez a fejlődési leállás a β- szelekció kritikus szakaszában erősen sugallja a V (D) J rekombináció lehetséges károsodását a TCR- β lókuszban az Xlf - / - PAXX - / - embriók timocitáiban. A V β 10-et és a D β 2- J β 2 klasztert érintő TCR- β átrendeződéseket PCR-rel elemeztük különböző genotípusú egerek timocitáiban, a 4c. Ábrán bemutatott módon. A D β 2 vagy V β 10 D β 2 szegmensek J β 2 elemekre történő átrendezése a PCR termékek létráját eredményezte egy intronos 3'J β 2 szondával, amelynek hossza a rekombináció során felhasznált J β 2 elemtől függ. folyamat. Az Xlf - / - PAXX - / - timocitákból származó DNS-ben nem volt kimutatható PCR termék, amely megfelel a D β 2 J β vagy a V β 10 D β 2 J β átrendeződéseknek (4c. Ábra, 8., 9., 16. és 20. sáv). ), bár könnyen azonosíthatók PAXX és Xlf egyetlen KO egerekben, igazolva a súlyosan káros V (D) J rekombinációs folyamatot PAXX és Xlf együttes hiányában.

Image

V (D) J rekombinációs hiba és a timociták károsodott fejlődése PAXX - / - / Xlf - / - E18.5 embriókban. a ) A timociták immunfestése wt, Xlf - / -, PAXX - / - és PAXX - / - Xlf - / - E18.5 embriókból. A felső panel (piros) a CD4 + CD8 + DP jelentős csökkenését mutatja a thymusban a PAXX - / - Xlf - / - embrionákból származó tímuszban. A DN (CD4 - CD8 - CD3 - ) timocitákat a CD44 és CD25 expressziója szerint (középső panel) osztottuk DN1 – DN4-re. Az alsó panel (zöld) mutatja a súlyos blokkot a DN3a (CD44 - CD25 + CD28 - ) átmeneten a DN3b (CD44 - CD25 + CD28 + ) átmeneten a PAXX - / - Xlf - / - embriókban. A B220 + CD19 + FL sejteket elemeztük a pro43-sejteket jelző CD43 expressziója szempontjából (középső panel). Az alsó panelen a sejteket a CD43 + B220 + CD19 + populáción elválasztottuk, és iIgM expresszió szempontjából elemeztük. ( b ) A timocita alpopulációk számszerűsítése a különféle PAXX / Xlf genotípusokban. A statisztikai elemzéshez Mann – Whitney tesztet használtunk. ( c ) PCR-stratégia a TCR β átrendeződés elemzésére Gartner et al. A 29. ábra és a PCR termékek autoradiogramja a TCR-J β próbával feltárva, amely igazolja, hogy a PAXX - / - Xlf - / - embriók timocitáiban sem D β- J β, sem V β D β J β átrendeződések hiányoznak. GAPDH-specifikus PCR-t használtunk betöltési kontrollként

Teljes méretű kép

A B-sejt érés a magzatban a magzati májban zajlik, az Ig nehéz lánc lókusz átrendeződése és expressziója során az E17.5 körül fordul elő, amikor az μH lánc detektálhatóvá válik intracellulárisan. 21 CD19 + B220 + B-vonalú sejt volt jelen a WT, Xlf - / - és PAXX - / - Xlf - / - E18.5 embriók FL-jében, igazolva a normál B-sejt vonal elkötelezettségét minden körülmények között (5a. Ábra) . Míg azonban a CD43 + B220 + pro-B sejtek ~ 20% -a expresszálta az intracitoplazmatikus μH láncot (iIgM) az PAXX +/− Xlf +/− embriók almaszövetségeiben, ez a populáció a CD43 + B220 + populációnak csak 5% -át tette ki. a PAXX - / - Xlf - / - DKO embriók (5a. és b. ábra), amelyek igazolják, hogy ezekben az embriókban az IgH lókusz átrendeződése vagy expressziója jelentős hibát mutat. Érdekes, hogy ennek a fenotípusnak a gravitációja követi a genotípus súlyosságát, az önmagában az Xlf KO hozzájárulásával statisztikailag szignifikáns mértékben (5b. Ábra). Ez észlelhető a magzati csecsemőmirigyben az Xlf - / - timociták részleges blokkolásával is a DN3a stádiumban, a wt embriókkal összehasonlítva (4a. Ábra). A TCR β visszaszorítását a thymusban PCR módszerrel végeztük az IgH lókusz rekombinációjának elemzésekor az FL-ben B-elkövetett sejtekben. Ez az elemzés egyértelműen kimutatta, hogy a PAXX - / - Xlf - / - embriókból (5.c ábra, 9., 10. és 11. sáv) a detektálható VH – DJH átrendeződés FL-ben szinte teljesen hiányzik, szemben a súlyos állatokkal. Érdekes módon az Xlf - / - genotípust hordozó összes embrió már csökkentette a V (D) J rekombináció hatékonyságát, amint azt a PCR termékek csökkentett jelintenzitása határozza meg, összhangban az IgM-t expresszáló pro-B sejtek csökkenésével a ezek az állatok.

Image

V (D) J rekombinációs hiba és csökkent B-sejt fejlődés PAXX - / - / Xlf - / - E18.5 embriókban. a ) FL sejtek immunfestése PAXX - / - Xlf - / -, Xlf - / - és PAXX - / - Xlf - / - E18.5 embriókból. Az alsó panelen a B-vonalú sejteket CD43 + B220 + populáción kapultuk meg, és intracitoplazmatikus IgM (iIgM) festés szempontjából elemeztük. ( b ) Az iIgM-pozitív sejtek mennyiségi meghatározása a különféle PAXX / Xlf genotípusok között, amelyek a PAXX - / - Xlf - / - embriók súlyos hiányát mutatják. ( c ) PCR-stratégia az IgH átrendeződés elemzésére Schlissel et al. A PCR termékek 30. és az autoradiogramja a JH3 próbával feltárt, amely az IgH átrendeződés súlyos hibáját bizonyítja PAXX - / - Xlf - / - embriók FL sejtjeiben. GAPDH-specifikus PCR-t használtunk betöltési kontrollként

Teljes méretű kép

A PAXX - / - Xlf - / - E18.5 embriókban a károsodott V (D) J rekombináció in vivo egyaránt a B- és a T-sejt vonalban egyeznek a v-Abl- transzformált pro-B-sejtvonalakat in vitro kromoszómába integrált V (D) J rekombinációs szubsztrátok felhasználásával. Összességében ezek a kísérletek azt mutatják, hogy noha az Xlf és a PAXX nagymértékben nélkülözhetetlenek a V (D) J rekombinációhoz, ezek egyidejű hibája jelentősen rontja a TCR β és IgH lókuszok átrendeződését a T- és B-sejtekben. a vonalfajták, illetve a tímuszban és az FL-ben az érésük blokkolását eredményezik. Ez összhangban áll az egykori születésű PAXX - / - Xlf - / - egérrel, amelynek nem volt thymusja és microspleenje volt. 12 Arra számítunk, hogy e két génnek az embrióhalálozás megkerülése érdekében a hematopoietikus rendszerben való feltételes ablációjának olyan súlyos kombinált immundeficiencia-fenotípusú élő állatokat kell eredményeznie, amelyeket az érett B- és T-limfociták hiánya jellemez.

Itt határozott in vivo funkcionális interakciót azonosítottunk a Xlf és a PAXX paralogok két DNS-javító faktorával, amint azt az egyidejű hiba szintetikus halálossága igazolja, amelyet a posztmitotikus idegsejtek hatalmas apoptózisa és a V (D) J rekombináció éretlen B és T limfocitákban. Ebben az értelemben a PAXX - / - Xlf - / - DKO egerek megoszlanak az XRCC4 és a DNS-Ligase IV egyetlen mutáns egerek fenotípusos tulajdonságainak legtöbbjében. A posztmitotikus idegsejtek túlélése és az adaptív immunrendszer fejlődése egyaránt a hatékony NHEJ-re támaszkodik, amint azt számos állatmodell és humán körülmény bizonyította. Ez a két funkció károsodása kifejezetten a PAXX - / - Xlf - / - állatoknál tehát megerősíti a PAXX szerepét a jóhiszemű NHEJ faktorban. Mások és korábban már beszámoltak arról, hogy az Xlf, mint a PAXX, nagyrészt nélkülözhetetlen a V (D) J rekombináció során. A nemrégiben a RAG2 és az Xlf közötti összefüggést kiemeltük egy kétszintű mechanizmus létrehozásának eszközeként, amely biztosítja a V (D) J rekombináció során képződött DNSdsb megfelelő helyreállítását, és ezáltal elkerüli a genetikai instabilitást. 14 A PAXX és az Xlf közötti hasonló funkcionális kölcsönhatás javasolható a nem befolyásolt V (D) J rekombináció figyelembevételére PAXX - / - egerekben, szemben a PAXX - / - Xlf - / - embriókkal. Ez a PAXX-et ugyanabba az oldalba helyezi, mint a RAG2-t ebben a védelmi mechanizmusban. Ennek megfelelően a RAG2 és a PAXX episztatikus, mivel kombinált mutációik nem befolyásolják a V (D) J rekombinációt a v-Abl pro-B sejtekben in vitro . 14 Hasonlóképpen, míg a V (D) J rekombináció komolyan veszélyeztetett az ATM - / - Xlf - / - egerekben, 23 hatékony az ATM - / - RAG2 cc-vel mutált v-Abl sejtekben, 14 pedig az ATM-et „ugyanazon az oldalon” helyezi el. mint RAG2 és PAXX, az Xlf-rel szemben. Valójában az ATM - / - PAXX - / - állatok nem mutatnak olyan hibát adaptív immunrendszerük fejlődésében, amely túlmutat az egyedüli ATM-hiánynál, amint azt a modell szerint elvárják. 12

Anyagok és metódusok

gRNS tervezés, klónozás és validálás

Két irányító RNS-szekvenciát választottunk ki a MuPAXX gén 1. és 2. exonján a CRISPOR webes eszköz segítségével (//crispor.tefor.net/crispor.py). A Cas9 hasítási hely közelében 24 gRNS-t átfedő restrikciós enzim (RE) diagnosztikai helyet választottunk ki, hogy megkönnyítsük a mutagenezis szűrését és az azt követő egér genotipizálást (kiegészítő S1A és B ábra). A kiválasztott vezető RNS-nek megfelelő kettős szálú DNS-oligonukleotidokat klónoztak a pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 vektorba (Feng Zhang nagylelkű ajándéka, Addgene, Cambridge MA, USA, # 42230), a Zhang laboratóriumi ajánlások szerint. 25 A mutagenezis pontozása és az egér genotipizálása céljából a vezető RNS célszekvenciákat körülvevő genomiális DNS-t PCR-amplifikáltuk (MuPAXX_F1: 5′-CAACCTTGAGTACCGCCCAT-3 ', MuPAXX_R1: 5′-CAACCTTGAGTACCGCCCAT-3' és emésztett eredményeként, 500 bp) akár Bsr BI-vel, akár Sac I RE-vel a PAXX1 és a PAXX2 mutagenezis elemzéséhez (S1C. és D. kiegészítő ábra). Az emésztetlen PCR-termékek mutagenizált DNS-molekulákat képviselnek. A CRISPR / Cas9 mutagenezis validálásához a pX330-at expresszáló két gRNS-t NEPA21 elektroporátorral (Nepagene, Ichikawa-City, Chiba, Japán) transzfektáltuk MEF-kbe a következő beállításokkal: impulzus1 175v / 5 ms / 50 ms / 2 × / 10 % / + -pulse2 20v / 50 ms / 50 ms / 5 × / 40% / + -. A genomi DNS-t 5 nappal később nyertük és PCR-RE alkalmazásával elemeztük (kiegészítő S1C ábra).

Mutáns egerek generálása

A PAXX mutáns egereket CRISPR / Cas9 alkalmazásával állítottuk elő, Masahito Ikawa laboratóriumában kidolgozott eljárás szerint. 16. Röviden: a Cas9-et kódoló pX330-ból származó plazmidot és a vezető RNS-t mikroinjektáltuk egér zigótákba, amelyeket szuperovulált egerek ampullaiból izoláltak. A szuperovulációhoz 5 NE PMS-t és 48 órával később 5 NE HCG-t intraperitoneálisan injektáltunk nőstény B6 / CBA F1 egerekbe ~ 6 hetes időtartamban. Ezt követően hím B6 / CBA F1 egerekkel párosítottuk őket (C57Bl6NCr és CBA egerek: Charles River Laboratories, Saint-Germain-Nuelles, Franciaország). Másnap az embriókat izoláltuk és M2 tápközegbe helyeztük (Sigma, St. Louis, CA, USA), és a plazmidot 5 ng / μl koncentrációban injektáltuk a pronukleuszba mikroszkóp segítségével (Nikon, Tokió, Japán) mikromanipulátorokkal (Narishige, London, Egyesült Királyság), Vacutip tartó pipettákkal (Eppendorf, Hamburg, Németország) és boroszilikát kapilláris üvegből készített házi injekciós pipettákkal (Harvard Apparat, Holliston, MA, USA), valamint Femtojet készülékkel (Eppendorf). Az ál-várandós egerek ~ 20 cigót kapott. Az eljárást a helyi etikai bizottság és a francia Oktatási és Kutatási Minisztérium hagyta jóvá (# 01501.03).

A PAXX1 egereket genotipizáltuk PCR-RE-vel (MuPAXX_F1, MuPAXX_R1, 500 bp), majd Bsr BI vagy Sac I RE emésztéssel ( S1C . És D. Ábra). Az Xlf KO egereket a korábban leírtak szerint genotipizáltuk. 17 PAXX1 és PAXX2 egeret hatszor kereszteztek a C57Bl / 6-on a feltételezett célpont nélküli mutáció elkülönítésére. A PAXX / Xlf kettős KO egereket PAXX - / - / Xlf +/− vagy PAXX +/− / Xlf - / - egerek keresztezésével állítottuk elő. Az összes egeret humánus módon feláldozták.

Phleomycin és IR érzékenységi vizsgálat

A T-limfocitákat 6-10 hetes splénekből izoláltuk és CD3 + -sejtekhez dúsítottuk mágneses szortírozással (Dynabeads Untouched egér T-sejtek, Invitrogen). A tisztított T-sejteket CellTrace BV421 fluoreszcens festékkel festettük (Thermo-Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, Franciaország). Összességében 3x105 T-sejtet 48 üreges lemezekre szélesztünk három példányban DMEN-Glutamax, 10% FCS, β- Me 0, 1%, nátrium-piruvát, 1%, penicillin és streptomycin és 1%, NEAA-val. A tenyészlemezeket besugározzuk (0–4 Gy), és hagyjuk 4 órán át inkubátorban 37 ° C-on hagyni, hogy a DNSdsb helyreálljon. A T-sejteket ezután CD3 / CD28-val bevont dynabeads (Thermo-Fisher Scientific) és 1000 u / ml IL2 hozzáadásával aktiváltuk. 4 napos tenyésztés után a sejteket anti-TCR β -PE-vel festettük (Sony, Weybridge, Surrey, Egyesült Királyság), és a FACS (LSR-Fortessa, Becton Dickinson, Rungis, Franciaország) elemezte a T-sejtek megoszlásának száma céljából. a CellTrace festék hígításával (2a. ábra). A proliferációs indexet (EI) a következő képlet szerint számítottuk ki:

Image

ahol N jelentése a sejtek számát az egyes (0– i ) osztott sejtpopulációkban. 26 Mindegyik mintánál kiszámítottuk az IR utáni relatív proliferációs indexet az IR nélküli proliferációhoz viszonyítva, és a minták összehasonlítása céljából rajzoltuk a dózis-válasz görbéket.

Az MEF-eket előállítottuk és transzformáltuk SV40 nagy T antigénnel (MEF-SV), az előzőekben leírtak szerint. 17 Phleomycin érzékenységi vizsgálatot végeztünk az MEF-SV-n az IncuCyte Live Cell Analysis Analysis System (Essen BioScience, Ann Harbor, MI, USA) alkalmazásával. Röviden: a különféle genotípusok MEF-SV-jét három példányban szélesztjük, lyukonként 3500 sejttel, 48 üregű lemezeken, és inkább inkább inkább (0, 50, 100 és 200 ng / ml) Phleomycin dózisokkal inkubáljuk. A lyukak valós idejű képeit (× 4 lencsét) rögzítettük 12 óránként 7 nap alatt, a sejtproliferáció ellenőrzése céljából. A maszkot, amely azonosítja az egyes képeken látható objektumokat, alkalmaztuk az egyes lyukak által elfoglalt terület (% összefolyás) mennyiségi meghatározására az egyes időpontokban (Kiegészítő S2A ábra). A sejtek életképességének / proliferációjának végső pontszámát úgy határoztuk meg, hogy a% konfluencia görbék alá eső területet idővel integráltuk téglalap alakú közelítéssel, amint azt az S2B. Ábra szemlélteti). Tekintettel i-re, a rögzítéshez használt különböző időpontokra (1-től n-ig ), a növekedési indexet (GI), amelyet a görbe alatti terület képvisel, a következő képlettel kell kiszámítani:

Image

Mindegyik kísérleti körülményre kiszámítják a sejtek életképességét a GI-hez viszonyítva, ha nincs gyógyszer (100% -os növekedésként kell meghatározni), és a Phleomycin koncentrációk szerint ábrázolják.

Immunoblot, histológia és immunhisztokémia

A PAXX expresszióját nyál poliklonális anti-C9orf142 antitest (ab126353, Abcam, Párizs, Franciaország) Western-blot-analízissel analizáltuk a timinafehérje-extraktumokon. Az embrionális fejeket egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten fixáltuk, 4% -os paraformaldehidbe merítve, és paraffinba ágyazzuk egy Tissu-tek processzorral (VIP, Leica, Wetzlar, Németország). Ezután egy mikrotom (Leica RM2125RT) alkalmazásával öt μm koronális metszetet kaptunk, és üveglemezeken rögzítettük szövettani elemzés céljából. A paraffin eltávolítása és a citrátkezelés után az agyszakaszokat 0, 5% Triton X-100-dal foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) permeabilizáltuk 15 percig, és 2 órán át inkubáltuk 7, 5% magzati szarvasmarha szérummal és 7, 5% kecske szérummal PBS-ben. A metszeteket nyúl anti-CC3-dal (Cell Signaling, Leiden, Hollandia, 9661, 1: 200) inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. Mosás után a metszeteket 1 órán át kecske anti-nyúl Alexa Fluor 488 vagy 594 konjugált szekunder antitesttel (Thermo-Fisher Scientific, 1: 400) inkubáltuk. Mosás után a nukleáris festést 4'-6-diamidino-2-fenilindollal végzett inkubációval érjük el, hogy az apoptózis indukcióját mennyiségileg meghatározzuk a pnotikus magok kimutatásával. A tárgylemezeket a Fluoromount alá helyeztük (Southern Biotechnologies Associates, Birmingham, AL, USA). A szöveteket fluoreszcens mikroszkóppal (Pathfinder, Nikon) vizsgáltuk × 10 vagy × 20 objektívvel, három csatornában (minden ábra piros, zöld és kék színben jelenik meg) különálló fájlként. Ezeket a képeket ezután a Photoshop szoftver (STD, San Jose, CA, USA) halmozta fel. Az összes statisztikai elemzést Prism-en végeztük (GraphPad, La Jolla, CA, USA, 7.00-as verzió).

ímmunofenotipi

A PAXX egerek immunfenotípusának meghatározását a leírtak szerint végeztük. A tímuszból és a lépből származó 17 T-sejtpopulációt anti-CD8 (5, 3–6, 7 klón), anti-CD4 (GK1, 5) és anti-CD3 (145–2C11) segítségével azonosítottuk. A lépsejt B-sejteket anti-B220 (R6-60.2), anti-IgM (II / 41) és anti-CD19 (6D5) alkalmazásával elemeztük. Az összes antitest a BD Biosciences-ből származik. Az áramlási citometriát a BD LSR-Fortessa-n (Becton Dickinson, Rungis, Franciaország) végeztük, és FlowJo-val (Ashland, OR, USA) analizáltuk. A PAXX / Xlf DKO embriók immunfenotípusának meghatározására az FL-ket és a thymusokat binokuláris nagyítólencse alatt mikrotizáltuk, egy 26 ml-es 1 ml-es fecskendő tűn átjuttattuk és szűrtük. A timociták esetében a sejtszuszpenziókat a BD Biosciences (Becton Dickinson, Rungis, Franciaország) Anti-CD25 (PC61 klón) és Anti-CD3ɛ (145-2C11), valamint a Sony anti-CD4 (GK1.5) fluoreszcensen jelölt antitestekkel festettük., anti-CD8 β (YTS156.7.7), anti-CD44 (IM7), anti-CD117 (2B8) és anti-CD28 (E18). A B-vonal esetében a sejtszuszpenziókat fluoreszcensen jelölt antitestekkel festettük a Biolegend-től (San Diego, CA, USA): anti-IgM (RMM-1 klón) és anti-CD43 (S11), a Sony-tól: anti-CD19 -APCCy7 (6D5) és anti-B220 (RA3-6B2). Az intracelluláris IgM festéshez a sejtszuszpenziókat először a fentiek szerint címkézzük, rögzítjük az eBioscience (ThermiFischer Scientific, Villebon sur Yvette, Franciaország) intracelluláris festőkészlet fixáló pufferével, és 30 percig inkubáljuk a Sony anti-IgM-mel (RMM-1 klón). .

TCR α repertoár tanulmány

A TCR α repertoár analízist SMARTer 5 'RACE cDNS amplifikációval végeztük, a korábban a timocitákon leírtak szerint. 17 CDR3 szekvenciát azonosítottak a LymAnalyzer 27 alkalmazásával, és ábrázolták egy Circos-plot segítségével, VDJtools alkalmazásával. 28 Minden TRAV – TRAJ asszociációt FlowJo-alapú fájlba vettünk, hogy kiszámítsuk a TRAV és a TRAJ proximális és disztális génhasználatát. A statisztikai elemzéseket Mann – Whitney nem-paraméteres t- teszttel végeztük Prism v6 alatt.

TCR β és IgH V (D) J átrendeződés elemzése

TCR β rearrangements (DJ β 2 and V β 10-DJ β 2) were analyzed by PCR on genomic DNA from E18.5 fetal thymuses of various genotypes according to Gartner et al. 29 Briefly, 1ng of thymic gDNA were amplified using primers TCRB-D2U-S 5′-GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′, TCRB-J2D-A 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′, TCRB-V10-S 5′-GCGCTTCTCACCTCAGTCTTCAG-3′, blotted, and hybridized using a PCR-derived TCR-J β 2 DNA probe (Jbeta2F-5′-GAATTCTTGGTAGCCCTTTTCTGC-3′ and Jbeta2 R-5′-GGGTGGAAGCGAGAGATGT-3′) as depicted on Figure 3b. For IgH rearrangements (VH–DJH) studies, FL CD19+ B-lineage cells were sorted on FACSAriaIII and analyzed by PCR on 1ng genomic DNA according to Schlissel et al. 30 Input DNA was analyzed using a GAPDH PCR.

Kiegészítő információk

Képfájlok

  1. 1.

    Kiegészítő 1. ábra

  2. 2.

    2. kiegészítő ábra

  3. 3.

    Kiegészítő 3. ábra

Word dokumentumok

  1. 1.

    Kiegészítő ábra legendák

    Kiegészítő információk kísérik ezt a dokumentumot a sejtek halálának és differenciálódásának weboldaláról (//www.nature.com/cdd)