A vemurafenib-rezisztens melanoma gátlása az pre-mrna splicing beavatkozásával | természetű kommunikáció

A vemurafenib-rezisztens melanoma gátlása az pre-mrna splicing beavatkozásával | természetű kommunikáció

Anonim

témák

  • Rákgenetika
  • A rák terápiás rezisztenciája
  • Melanóma
  • RNS splicing

Absztrakt

A szerin / treonin kináz BRAF mutációit a melanómák több mint 60% -ában találják meg. A legelterjedtebb melanóma mutáció a BRAF (V600E), amely konstitutív módon aktiválja a MAPK jelátviteli szakaszát. A Vemurafenib erős RAF-kináz-inhibitor, figyelemre méltó klinikai aktivitással rendelkezik a BRAF (V600E) pozitív melanóma daganatokban. A betegek azonban gyorsan kialakulnak a vemurafenib-kezeléssel szembeni rezisztencia. Az egyik rezisztenciamechanizmus a BRAF alternatív splicing izoformáinak megjelenése, ami a RAS-kötő domén eliminációjához vezet. Itt azonosítottuk a pre-mRNS splicing-kel való interferenciát, mint a vemurafenib-rezisztencia leküzdésének mechanizmusát. Megállapítottuk, hogy a kismolekulájú pre-mRNS splicing modulátorok csökkentik a BRAF3–9 termelést és korlátozzák a vemurafenib-rezisztens sejtek in vitro növekedését. A xenograft modellekben az pre-mRNS splicingbe történő beavatkozás megakadályozza a tumor kialakulását és lelassítja a vemurafenib-rezisztens daganatok növekedését. Eredményeink egy intronos mutációt azonosítanak egy RNS-splicing-mediált RAF-inhibitor-rezisztencia mechanizmus molekuláris alapjául, és a pre-mRNS-splicing interferenciát azonosítottuk a BRAF melanoma gyógyszerrezisztencia lehetséges terápiás stratégiájaként.

Bevezetés

A szerin / treonin-kináz BRAF egy proto-onkogén, amely a MAP-kináz-útvonalon hat, és összeköti a mitogénjeleket a sejtproliferáció transzkripciós szabályozó hálózataival. A BRAF mutációi nagyon elterjedtek, és az 1, 2, 3 melanómák több mint 60% -ában fordulnak elő. A leggyakoribb melanóma mutáció a BRAF (V600E), amely konstitutív módon aktiválja a 4-es jelátviteli irányú jelátviteli irányt.

A Vemurafenib hatékony rövid távú terápiás szer a BRAF (V600E) pozitív melanoma 5 kezelésére . A betegek azonban mindig a 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 gyógyszerrel szembeni rezisztenciát mutatnak . Az ellenállás a mitogén-aktivált protein (MAP) / extracelluláris szignál-szabályozott kinázok (ERK) jelátviteli útjainak újbóli aktiválásával állhat elő, beleértve a 7, 11 jelzésű jelátviteli útvonalakat, beleértve az upstream patkány sarcoma (RAS) aktivációt RAS-mutációval, a receptor tirozin-kinázok felszabályozásával 6, 14, a BRAF (V600E) 12 amplifikációja, aktiválva a mutációkat a MAPK / ERK kináz (MEK) 8-ban és az epidermális növekedési faktor receptorban (EGFR) 15, 16 . A rezisztens daganatok ∼ 30% -ában az RAF-gátló vemurafenibtel szembeni rezisztenciát alternatív splicing biztosítja olyan BRAF-izoformák létrehozásával, amelyekben nincs RAS-kötő domén (RBD), amelyet a 3–5. Exon kódol (17., 18., 19. hivatkozás; 1a. Ábra) ). RBD hiányában ezek a BRAF izoformák még alacsony RAS szint mellett is dimerizálódnak és gyógyszerrezisztenciát eredményeznek 13 .

Image

a ) A vemurafenib-rezisztens melanómás betegekben észlelt AS események sematikus ábrázolása. Csak az intronok kerülnek méretezésre, az intron 1 = 63 kbp. ( b ) A szülői és rezisztens C3 sejtek mennyiségi qPCR elemzése. A feltüntetett értékek az összes BRAF mRNS-re normalizált izoforma értékeket jelentik. A C3 rezisztencia izoform szintjét 1-re állítottuk, #Signal a detektálási határ alatt volt. ( c ) Az U2OS sejteket wt-vel vagy mutáns BRAF riporterrel transzfektáltuk. Az mRNS-szinteket 48 óra elteltével meghatározzuk qPCR alkalmazásával. A feltüntetett értékek az izoform értékeket normalizálják a zöld fluoreszcens protein (GFP) mRNS teljes mennyiségéhez viszonyítva. Az izoform szinteket a wtBRAF-ban 1-re állították. ( D ) Az intron 8 3 'SS-nek a másodlagos szerkezete. Az egyes nukleotidok színkódolt párosítási valószínűsége feltüntetve. ( e ) Az U2OS sejteket a jelzett BRAF riporterrel transzfektáltuk. Az mRNS-szinteket 48 óra elteltével meghatározzuk qPCR alkalmazásával, a BRAF3–9 izoform értékeit normalizáltuk a GFP mRNS teljes mennyiségéhez. A wtBRAF izoform-szintjét 1-re állítottuk. ( B, c és e ) Az értékek három független kísérlet átlagát mutatják ± sd (* P <0, 05, ** P <0, 01, t- teszt).

Teljes méretű kép

Itt vizsgáltuk a splicing moduláció alkalmazását a vemurafenib ellenállás leküzdésének eszközeként. Megmutatjuk, hogy a BRAF gén intron 8 pontmutációja a vemurafenibel szembeni rezisztenciát közvetíti egy gyógyszer-rezisztens sejtvonalban. A splicing moduláció xenograft-modell alkalmazásával megfordítja a rendellenes BRAF splicing-et és lassítja a vemurafenib-rezisztens sejtek növekedését in vitro és in vivo . Eredményeink alátámasztják a moduláció splicing modulációjának kezelését olyan rák terápiájában, amelynek molekuláris függősége van egy gyengén splicing onkogén izoformára.

Eredmények

Az intronic BRAF vemurafenib rezisztencia mutáció azonosítása

A vemurafenibel történő pre-mRNS-nek splicing-közvetített rezisztencia molekuláris alapjának feltárása érdekében kihasználtuk a vemurafenib-rezisztens C3 humán melanóma sejtek rendelkezésre állását 13 . Ezeket a sejteket SKMEL-239 sejtek hosszan tartó BRAF-gátló kezelésével hozták létre, amely egy BRAF-et (V600E) 13 expresszáló betegből származó melanóma sejtvonal. A vemurafenib-rezisztens betegek helyzetéhez hasonlóan a C3-sejtekben a rezisztenciát az alternatív módon összekapcsolt BRAF3–9 izoform expressziója közvetíti, amelyben nincs 4–8 exon (1a. Ábra) 13 . A BRAF (V600E) mutáció heterozigóta jellegével összhangban kimutattuk mind a BRAF3–9, mind pedig a teljes illesztésű BRAF-et (BRAF8–9) a rezisztens C3 sejtekben. A szülői sejtvonalban nem detektáltunk BRAF3–9-et (1b. Ábra és kiegészítő 1a. Ábra). A BRAF3–9 emelkedett szintje a C3 sejtekben nem más BRAF izoformák nonszensz általi lebomlásának következménye, mivel az UPF1, a nonszencia-közvetített mRNS bomláskomplexének egyik komponensének elnémítása nem befolyásolta a BRAF3–9 vagy 7–9 izoformákat (Kiegészítő 1b. Ábra, c; P érték <0, 01). A genomi BRAF összehasonlító szekvenálása C3-ban és szülői SKMEL-239 sejtjeiben a C3-sejtekben a BRAF (V600E) allélban a 8-as intron 3 'illesztési helyétől (SS) 51. pozícióban lévő C-to-G mutációt azonosították (Kiegészítő 1d ábra). Az −51 mutáció a 8. intron előrejelzett elágazási pontjára (BP) térképez (ref. 20).

A BRAF3–9 izoforma képződése intronos mutációval

A −51 BRAF mutáció elegendő volt a BRAF3–9 kialakulásának elősegítéséhez. Egy BRAF minigenesben, amely a 3., 4., 8., 9. exont és a 3. és 8. intront tartalmaz (kiegészítő 1e. Ábra), a mutáció a BRAF3–9 izoformának elősegítését előnyben részesítette, megközelítőleg kétszeresére és kölcsönösen csökkent BRAF8–9-re a kvantitatív megítélés alapján. PCR (qPCR) és félig qPCR a vad típusú (wt) kontrollhoz képest (1c. Ábra és kiegészítő 1g. Ábra; P érték <0, 01). Ezeket a hatásokat megfigyelték, függetlenül attól, hogy a riportereket bevezették-e szülői vagy rezisztens C3 sejtekbe, kizárva annak lehetőségét, hogy a sejtekre jellemző hatások a BRAF splicingjára vonatkoznak (kiegészítő 1h. Ábra).

A becsült 8 intron BP mellett a 20 szekvenciaanalízis és a 21 szekunder struktúranalízis két rejtjeles BP (cBP) jelenlétét jelzi a 8-as intron −88, illetve –109 nt helyzetében, a 3 ′ SS-től felfelé (ábra 1d). Annak tesztelésére, hogy ezek a cBP-k felelősek-e a BRAF3–9 splicing-hez −51 mutáció jelenlétében a vemurafenib-rezisztens sejtekben, a cBP-ket mutáltuk a wt vagy a mutáns BRAF összefüggésében (1e. Ábra). Mindkét feltételezett cBP mutációja a wtBRAF háttérben csak elhanyagolható hatással volt a BRAF3–9 illesztésre (1e. Ábra). Ezzel szemben ezeknek a helyeknek a mutációja a –51 vemurafenib-rezisztens BRAF mutáns kapcsán 40% -kal csökkent a BRAF3–9 felhasználásban (1e. Ábra; P érték <0, 05). Ezen felül az SRSF6-kötő hely mutációja a –129-nél, az SRSF6-helyek mutációja azonban a 8. exónnál, valamint az SRSF6, de nem az SRSF1 vagy 3 knockálása rezisztens C3 sejtekben, az endogén BRAF3–9-t ∼ 30% -kal csökkentette (Kiegészítő 1i. És j. Ábra; P érték <0, 05) és az U2OS sejtekben, amelyek stabilan expresszálják a BRAF minigént (kiegészítő 1k. És l. Ábra; P érték <0, 01). Az SRSF6 mRNS-szintekben nem mutattak különbséget a szülői és rezisztens sejtvonalakban az RNS-interferencia (RNAi) kezelés előtt (Kiegészítő 1m. Ábra).

Az illesztéses modulátorok csökkentik a BRAF3–9 termelését és aktivitását

Tekintettel az alternatív splicing elmozdulására a BRAF3–9 izoform felé a vemurafenib-rezisztens sejtekben, megvizsgáltuk, hogy a rezisztens sejteket kezeljük-e a spliciceostatin A (SSA) 22 splicing modulatorral vagy annak analóg meayamicin B-vel (MAMB) 23, 24, amely célzott splicing az SF3B1 faktor gátolja a BRAF3–9 képződését. A C3-rezisztens sejtek SSA-val történő kezelése (100 ng; 9 óra) csökkentette a BRAF3–9 mennyiségét a rezisztens C3 sejtekben (2a. Ábra; P érték <0, 05). Kontrollként a BRAF8–9 splicingot az SSA kezelés nem befolyásolta sem szülői, sem rezisztens sejtvonalakban (2a. Ábra és kiegészítő 2a. Ábra). Az SSA hatása specifikus volt, mivel közvetlen SF3B1 célpontjának 60% -kal csökkentette az RNAi (2b. Kiegészítő ábra; P érték <0, 01) utánozta ezeket a hatásokat (Kiegészítő 2c. Ábra, d; P érték <0, 05). A MAMB-vel végzett kezelés (10 nM; 9 óra) hasonló hatásokkal járt (2b. Ábra; kiegészítő 2e. Ábra). További specifikusság-ellenőrzésként megfigyeltük az Erk-1 MAPK gén AS-jét (ref. 25), és nem találtunk változást sem a szülői, sem a rezisztens sejtvonalakban (Kiegészítő 2f. Ábra). Ahogy az várható volt, a BRAF3–9 splicing csökkentése a BRAF3–9 protein izoformjának csökkenését eredményezte a rezisztens sejtvonalban (2c. Ábra), és az ERK jelátvitel csökkenésével jár (2d. Ábra és a 2g., Kiegészítő ábra); érték <0, 05). Mint a 13. előzőekben látható, az összes BRAF szint alacsonyabb a rezisztens C3 sejtvonalban a szülőihez képest (2c. Ábra), ám az ellenálló sejtekben az ERK aktivitása megnövekedett (2d. Ábra és kiegészítő 2g. Ábra, h). Megállapítottuk, hogy a splicing interferencia antagonizálja a BRAF3–9 termelést.

Image

( a ) A Vemurafenib-rezisztens C3 sejteket 100 ng ml −1 SSA-val kezeljük 9 órán át. Az mRNS-szinteket qPCR alkalmazásával határoztuk meg. A feltüntetett izoforma értékeket a teljes BRAF mRNS-re normalizáljuk. Az izoform szintet a kontrollban 1-re állítottuk. ( B ) A Vemurafenib-rezisztens C3 sejteket 10 nM MAMB-vel kezeltük 9 órán át. Az mRNS-szinteket qPCR alkalmazásával határoztuk meg. A feltüntetett izoforma értékeket a teljes BRAF mRNS-re normalizáljuk. Az izoform szintet a kontrollban 1-re állítottuk. ( C és d ) A szülői és rezisztens C3 sejteket 10 nM MAMB-vel kezeltük 9 órán át. ( c ) Az immunoblot-ot a jelzett antitestekkel végeztük. ( d ) A BRAF-aktivitást a pERK1 / 2 szint mérésével határoztuk meg, Meso Scale Discovery (MSD) technológia alkalmazásával. SSA esetén a MAMB kísérleti kontroll sejteket metanollal vagy dimetil-szulfoxiddal, a vegyület oldószerével kezeltük. ( a, b és d ) Az értékek három független kísérlet átlagát képviselik ± sd (* P <0, 05, ** P <0, 01, t- teszt). GAPDH, gliceráldehid-3-foszfát-dehidrogenáz.

Teljes méretű kép

Az összekapcsoló modulátorok gátolják a vemurafenib-rezisztens sejtproliferációt

Mint korábban kimutattuk, a vemurafenib-rezisztens C3 sejtek proliferációja a BRAF3–9-től függ 13 . Annak tesztelésére, hogy a splicing interferencia gátolja-e a gyógyszer-rezisztens sejtek szaporodását, a szülői SKMEL-239 vagy a rezisztens C3 sejteket 3 napig kezeljük MAMB-val. A sejtek túlélésének biztosítása érdekében a kezelés 3 napján az alkalmazott dózistartomány (0, 05–0, 5 nM) ∼ 50-szer alacsonyabb volt, mint a rövid távú összeillesztési vizsgálatokhoz alkalmazott rutin dózis (10 nM) 26 . A rezisztens C3 sejtek szignifikánsan érzékenyebbek voltak az MAMB-re a kontroll szülő sejtekhez képest vemurafenib hiányában (3a. Ábra; P érték <0, 0001). A rezisztens C3 sejtekben a 0, 2 nM dózisban bekövetkező csökkent proliferációs sebességet a BRAF3–9 izoform csökkenése kísérte (kiegészítő 3a., B. Ábra). Fontos szempont, hogy az interferencia összeillesztése újraérzékenyítette a rezisztens C3 sejteket a vemurafenibre, és szaporodási potenciálját a gyógyszerre reagáló szülősejtek szintjéhez csökkentette (3b. Ábra; P érték <0, 001). A C3 sejtek vemurafenibre történő újbóli szenzibilizációját a BRAF3–9 csökkentése és ennek következtében az ERK jelátvitel csökkentése kísérte (kiegészítő 3c. Ábra, d; P érték <0, 05). Az illesztési modulációnak nincs hatása a szaporodásra vagy az ERK jelátvitelre a szülői sejtvonalban (kiegészítő 3d., E. Ábra). Ezek az eredmények bizonyítják, hogy az SSA és az MAMB csökkenti a BRAF3–9 illesztést és következésképpen az ERK jelátvitelt.

Image

( a ) A szülői és rezisztens C3 sejteket a megadott MAMB koncentrációval kezeltük, és a sejtek életképességét 3 nap múlva meghatározzuk. b ) A Vemurafenib érzékenységi görbéi 3 napos szülői és rezisztens C3 sejtek esetén 1 ng ml −1 SSA jelenlétében vagy hiányában. ( c ) A szülői M397 és a rezisztens M397AR sejteket a megadott MAMB koncentrációval kezeltük, és a sejtek életképességét 3 nap múlva meghatározzuk. Az értékek három független kísérlet átlagát jelölik, ± sd ( P <0, 001, varianciaanalízis kétirányú).

Teljes méretű kép

A vemurafenib-rezisztens daganatok becslések szerint 30% -a különféle BRAF splicing izoformákat tartalmaz 13, 19 (1a. Ábra). Annak tesztelésére, hogy a splicing interferencia specifikus-e a BRAF3–9-re, vagy alkalmazható-e más BRAF izoformákra, a vemurafenib-rezisztens M397AR sejtvonalat, amely BRAF1–11-et fejezi ki, MAMB-vel (10 nM, 9 h) 12, 27 kezeltük. A BRAF1–11 50% -kal csökkent a rezisztens M397AR sejtekben (Kiegészítő 3f. Ábra; P érték <0, 05). Ezt a hatást nem az általános splicing-elnyomás okozta, mivel a BRAF10–11 splicing csak mérsékelten csökkent az MAMB-kezeléssel az M397 vagy M397AR sejtvonalakban (Kiegészítő 3f. Ábra, g). Amint azt a C3 sejteknél megfigyeltük, a rezisztens M397AR sejtek érzékenyebbek voltak az MAMB-re, mint a kontroll M397 sejtek (3c. Ábra; P érték <0, 0001). Ezenkívül a splicing modulációnak nem volt hatása a vemurafenibre rezisztens sejtvonalak két sorozatának proliferációjára nem RNS splicing-mediált mechanizmus segítségével, 14, 28 (3h, i. Kiegészítő ábra).

A splicing moduláció gátolja a vemurafenib-rezisztens daganatok in vivo növekedését

A splicing modulációnak a daganatokban való alkalmazhatóságának feltárására in vivo xenograft kísérleteket végeztünk. A szülői SKMEL-239 vagy a vemurafenib-rezisztens C3 sejteket (1x106) szubkután injektáltuk immunhiányos NSG egerekbe, és az állatokat alacsony SSA-adaggal kezeltük (0, 28 μg kg −1 ; injekcióként ip. 3 naponta). Noha az SSA nem befolyásolta a szülő sejtek tumorképződését, a vemurafenib-rezisztens sejtek által kialakult tumorok hatékonyan blokkolódtak SSA jelenlétében (4a. Ábra és kiegészítő 4a. Ábra; P érték <0, 05). A vemurafenib-rezisztens daganatok egyáltalán nem növekedtek (3/4), vagy legalább tízszer kisebb súlyúak voltak, mint az átlagos szülő daganat (1/4). Annak megállapítására, hogy a splicing modulációnak volt jótékony hatása a már kialakult vemurafenib-érzékeny vagy rezisztens daganatokra - az egyértelműen kimutatható 6 napos SKMEL-239 vagy C3 daganatokkal rendelkező NSG egereket önmagában vemurafenibel vagy SSA-val (0, 28 μg kg) kezelték −1 ; intraperitoneális (ip), 3 naponta beadva). A várakozások szerint a vemurafenib csökkentette az SKMEL-293 méretét, de nem a C3-tumorok méretét (4b. Ábra; kiegészítő 4b. Ábra). Az SSA önmagában nem volt gátló hatás, és nem gátolta a vemurafenibet gyógyszerérzékeny SKMEL-293 daganatokban (4b. Ábra). Ezzel szemben az SSA hatékonyan gátolta a vemurafenib-rezisztens C3 sejtek daganatos növekedését önmagában vagy a vemurafenib-del kombinálva (4b. Ábra és kiegészítő 4c. Ábra; P érték <0, 05). Fontos szempont, hogy a rezisztens C3 daganatokban megfigyelt tumorméret csökkenésével a BRAF3–9 csökkenése következett be, de a BRAF8–9 csökkenése kísérte (4c. Ábra és kiegészítő 4d. Ábra; P érték <0, 001). Megállapítottuk, hogy a rezisztenciát okozó BRAF3–9 izoforma kiküszöbölése az pre-mRNS splicing beavatkozása révén hatékony eszköz a vemurafenib-rezisztencia leküzdésére in vivo .

Image

( a ) A daganat súlyának értékei a kísérlet végpontján (20. nap) négy egér ± SEM átlagát jelentik (* P <0, 05, t- teszt). ( b ) A daganatokat 6 napig alakítottuk ki szülői vagy rezisztens C3 sejtek és NSG egerek injekciózásával, majd vemurafenib analóggal, PLX4720 kezeltük chow-ban keverve (417 mg gyógyszer / kg chow; 67 mg kg −1 egerekben) és / vagy 0, 28 μg kg −1 SSA. A tumor tömegének értékei a kísérlet végpontján (35. nap) a 6 egér ± SEM átlagát jelentik (* P <0, 05, t- teszt). c ) A rezisztens C3 daganatok mennyiségi PCR analízise SSA-val vagy anélkül. Az mRNS értékeket normalizálják a teljes BRAF mRNS-re. A kontrollt 1-re állítottuk. Az értékek 6 egér ± sd átlagát jelzik (*** P <0, 001, t- teszt).

Teljes méretű kép

Vita

Itt egy pontmutációt azonosítunk a BRAF-ben , amely a melanómasejteket rezisztenssé teszi a klinikailag alkalmazott BRAF-gátló vemurafenib ellen. A mutáció feltételezett splicing ág-pontban helyezkedik el, és elősegíti a BRAF3–9 splicing izoforma képződését, amely vemurafenibrezisztenciát biztosít. Megállapítottuk azt is, hogy számos pre-mRNS splicing modulátor, beleértve az SSA-t és az MAMB-t, képes ellensúlyozni a BRAF3–9 képződését és leküzdeni a splicing-mediált vemurafenib ellenállást. Az SSA megfigyelt gátló hatása a vemurafenib-rezisztens sejtek tumorképződésére, még a BRAF (V600E) inhibitor nélkül is, azt jelzi, hogy a BRAF3–9 izoform eliminálása elegendő a jótékony hatás eléréséhez. Ez az értelmezés összhangban van a BRAF3–9 domináns funkcionális nyereségmechanizmusával, amely konstitutív BRAF-aktivitással rendelkezik, mivel elveszíti RAS-kötő doménjét (RBD) 13 . Noha a −51 mutáció prevalenciája jelenleg nem ismert, az RNS splicing-mediált vemurafenib-rezisztencia megcélzása valószínűleg általános klinikai jelentőséggel bír, mivel a vemurafenib-kezelésben részesülő betegekben a rezisztens daganatok ∼ 30% -áról beszámoltak arról, hogy expresszálnak rezisztenciát közvetítő BRAF splicing-et izoformák 9, 13, 19 . Mivel az összes pre-mRNS splicing-mediált rezisztens daganat közös splicing izoformákkal rendelkezik, amelyek eltávolítják az RBD-t a BRAF 13-ban, várható, hogy a splicing interferencia hatékony lehet, függetlenül a pontos ellenállás mutációtól. Ezt a felfogást alátámasztja azt a megállapítást, hogy a splicing interferencia megakadályozza a vemurafenib-rezisztens BRAF1–11 izoforma képződését. A kísérleteinkben alkalmazott splicing modulátorok dózisa szignifikánsan alacsonyabb, mint az SSA / MAMB analóg E7107-rel kapcsolatos korábbi klinikai vizsgálatokban alkalmazott (referencia 29., 30.), csökkentve a toxicitás kockázatát, és sugallva annak megvalósíthatóságát klinikai körülmények között. Ennek alátámasztására az SSA alacsony dózisai nem voltak hatással a szülősejtek vagy daganatok növekedésére, és egerekben nem mutattak észlelhető toxikusságot. Eredményeink azt sugallják, hogy a splicing gátlása kiegészítő megközelítés lehet a vemurafenib és a MEK vagy hiszton-dezacetiláz (HDAC) inhibitorok jelenleg alkalmazott kombinált terápiájának 14, 15, 31, 32, 33 . Tekintettel a pre-mRNS splicing-mediált rezisztencia magas prevalenciájára, az pre-mRNS splicing célzása hasznos módszer lehet a melanómás betegek gyógyszerrezisztenciájának leküzdésére.

Mód

Sejtvonalak

SKMEL-239 szülői és vemurafenib-rezisztens C3-sejtvonalak (David Solit, MSKC ajándéka), valamint az M397 / M397AR (Antoni Ribas, UCLA egy ajándéka), WM938B / WM983B BR és 451 Lu / 451 Lu BR sejt sorokat (Meenhard Herlyn, a Wistar Intézet kedves ajándéka) RPMI-ben szaporítottuk, 10% magzati szarvasmarha szérummal kiegészítve. U2OS (ATCC szám: HTB-96) sejteket 10% magzati szarvasmarha szérummal kiegészített DMEM-ben tenyésztettünk; az összes sejtvonalat 37 ° C-on és 5% CO 2 atmoszférában tartottuk.

A szekvenálás

A szekvenálást a 3. intron 5 'SS és 3' SS 'tisztított PCR-termékein végeztük a GENEWIZ, Inc.-nél.

BRAF riportergén és transzfekció

A riportergént úgy állítottuk elő, hogy a PCR-termékeket összefűztük a GeneArt Seamless Cloning Technology (Life Technologies) alkalmazásával, és a terméket a pEGFP-N1 vektorba (Clontech) klónoztuk. A wtBRAF és a mutBRAF riporterek előállításához használt PCR reakciókat úgy állítottuk elő, hogy szülői vagy rezisztens C3 sejtvonalak genomikus DNS-ét használtuk templátként. A mutagenezist QuikChange II XL helyileg irányított mutagenezis készlettel (Agilent Technologies) végeztük. A sejteket Nucleofector Technology (Lonza) alkalmazásával transzfektáltuk. Az ebben a tanulmányban alkalmazott primereket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.

RNSi

Az OnTarget Plus SMARTpool az SF3B1, UPF1, SRSF1, SRSF3 és SRSF6 ellen a Dharmacon-tól (Lafayette) szerezték be. A sejteket 20-50% -os konfluenciára tenyésztettük és siRNS-sel transzfektáltuk DharmaFECT 1 reagens (Lafayette) felhasználásával.

qPCR

Az RNS-t az RNeasy plus mini kit (QIAGEN) segítségével izoláltuk a sejtekből. A cDNS szintézist nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlettel (Applied Biosystems) végeztük. qPCR-t SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) készülékkel végeztünk a Biorad iCycler készüléken. Az összehasonlító Ct-módszert alkalmaztuk a transzkripciók kvantifikálására, és a delta Ct-t rutinszerűen mértük három példányban. Az ebben a tanulmányban alkalmazott primereket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. Az Erk1 és cErk1 primereket másutt tervezték meg25.

Másodlagos szerkezet, BP és SRSF6-kötő hely becslés

A teljes minigene-szekvenciát (2684 nt) a Bécsi RNAfold szerverrel (//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) 21 hajtottuk össze, hogy megkapjuk a minimális szabad energiaszerkezetet, a partíciós funkciót és a bázis párosítási valószínűségek. Az eredményeket összehasonlítottuk az mfold szerverrel (//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold) 34, 35, 36 . Az intron 8 3 'SS-jét (1000 nt) elemeztük az ESEfinder 3.0 (referencia 20) alkalmazásával a BP és a két cBP meghatározására. A teljes minigene szekvenciát (2684 nt) ESEfinder 3.0_ENREF_19 (20. hivatkozás) alkalmazásával elemeztük az SRSF6 lehetséges kötőhelyeinek azonosítása céljából.

leképezés

A sejteket úgy rögzítettük, hogy 4% paraformaldehidet adtunk PBS-ben közvetlenül a tenyészközeghez, 1: 1 para / közeg arányban, és inkubáltuk 15 percig szobahőmérsékleten. A sejteket ezután háromszor PBS-sel mostuk és DRAQ5-vel (Biostatus Limited) 1: 5000 foszfát-oldattal festettük. Az automatizált képalkotási lépéseket Opera rendszerrel (Perkin-Elmer) hajtottuk végre. A képeket 488/640 nm gerjesztő lézerrel (első felvétel) és 568 nm gerjesztő lézerrel (második felvétel) készítettük. A képeket az Acapella szoftvercsomag (Perkin-Elmer) segítségével elemeztük. A zöld / piros arányt úgy számoltuk, hogy a 488 nm-es csatornán az átlagos nukleáris intenzitás jel és az 568 nm-es csatornán az átlagos nukleáris jel aránya volt. Mindegyik kísérleti körülményben legalább 1000 magot elemeztünk.

Transzplantációs vizsgálatok

Hathetes hím NOD / SCID / interleukin 2 receptor-y null egereket (NSG; Jackson Laboratory) tartottak patogénmentes körülmények között. A daganatok kialakulásához a sejteket (injekciónként 1x106) 35 μl PBS-ben összekeverjük 15 μl Matrigel-lel (BD BioScience) és szubkután injektáltuk az egerek oldalához. Az egereket egy nappal az injekció beadása előtt szőrtelenítő krémmel borotváltuk meg. SSA-t (0, 28 μg kg- 1 ) injektáltunk ip-ben (100 μl) a jelzett naptól számított 3 naponta. A kontroll egereket metanollal (SSA oldószer) kiegészített PBS-sel injektáltuk. A kísérlet időtartama alatt a 6. napon kezdődött a vemurafenib analóg PLX4720 táplálékba keverése (417 mg gyógyszer / testtömeg; 67 mg kg –1 egerekben). A daganatok növekedését hetente kétszer, digitális féknyereg alkalmazásával vizsgáltuk. A daganatok térfogatát a d × D képlettel számítottuk, ahol d és D a legrövidebb és a leghosszabb átmérő. A végpontnál a daganatokat eltávolítottuk, súlyoztuk és az RNS-t extraháltuk. Az összes eljárást az Állategészségügyi Állat-felhasználási és Ápolási Nemzeti Intézetek jóváhagyták.

Proliferációs vizsgálat

Lyukonként kétezer sejtet vettek be egy 96 üregű lemezen; A sejteket másnap kezeltük. Az SSA-t, a MAMB-t vagy a vemurafenibet (PLX4032, Selleck) összekeverjük a megadott adagba. A kontroll sejteket mind dimetil-szulfoxiddal, mind metanollal, vagy dimetil-szulfoxiddal kezeltük, a PLX4032, az SSA és az MAMB oldószereivel. A proliferációt 3 nap elteltével a CellTiter 96 (Promega) vizsgálta a gyártó utasításai szerint.

pERK1 / 2 vizsgálat

A pERK1 / 2 és az összes ERK1 / 2 kimutatására Meso Scale Discovery lemezeket használtunk a gyártó protokollja szerint. A lemezeket a SECTOR Imager készüléken elemeztük.

immunoblot

A sejteket összegyűjtöttük és proteázokkal és foszfatáz inhibitorokkal kiegészített RIPA lízis pufferrel lizáltuk, és az extraktumokat 4–12% Bis-Tris gélen futtattuk és polivinilidén difluorid membránra vittük. BRAF antitest (F-7): sc-5284 (1: 1000), Anti-Hsc70 antitest [1B5] (ab19136, 1: 25 000).

Kiegészítő információk

PDF fájlok

  1. 1.

    Kiegészítő információk

    Kiegészítő 1-4. Ábra és 1. kiegészítő táblázat

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával vállalja, hogy betartja feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha valami visszaélésszerűt talál, vagy amely nem felel meg a feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg, hogy nem megfelelő.