Az emberi kaszpáz-4 és a kaszpáz-5 szabályozza az egylépéses nem-kanonikus gyulladásos aktiválást monocitákban | természetű kommunikáció

Az emberi kaszpáz-4 és a kaszpáz-5 szabályozza az egylépéses nem-kanonikus gyulladásos aktiválást monocitákban | természetű kommunikáció

Anonim

témák

  • Inflammasome
  • Gyulladásos betegségek
  • Monociták és makrofágok
  • Jelátvitel

Absztrakt

A monociták elősegítik a korai gazdaszervezet válaszát a fertőzésre, felszabadítva a kulcsfontosságú gyulladást elősegítő citokineket, mint például az IL-1β. A biológiailag inaktív IL-1β prekurzort gyulladásokkal, kaszpáz-1-t aktiváló multi-protein komplexekkel aktív formába dolgozzák fel. Az emberi monociták nem-szokásos, egylépéses gyulladásos aktiválódási utat mutatnak, önmagában a lipopoliszacharid (LPS) hatására. Noha ez a vonal korlátozott mechanizmus valószínűleg hozzájárul az endotoxin sokk patológiájához, az ezt a mechanizmust szabályozó jelátviteli útvonalak jelenleg ismeretlenek. Jelenleg beszámolunk arról, hogy a kaszpáz-4 és a kaszpáz-5 közvetíti az IL-1α és IL-1β felszabadulását az emberi monocitákból az LPS stimuláció után. Noha a kaszpáz-4 még nem tisztítható, a kaszpáz-5 gyors feldolgozáson megy keresztül LPS-kezelés során. Azt is azonosítunk egy további kaszpáz-5 hasítási terméket az LPS-stimulált monocitákban, amely korrelál az IL-1 szekrécióval. Ez az egylépéses út Syk aktivitást és Ca2 + fluxust igényel, amelyet CD14 / TLR4-mediált LPS internalizálás vált ki. A kaszpáz-4/5 azonosítása az emberi monocitákban az egylépéses gyulladásos aktiválás kulcsfontosságú meghatározóiként potenciális célokat jelent az endotoxin-sokk terápiás beavatkozásához.

Bevezetés

A monociták kulcsfontosságú mediátorok a mikrobiális fertőzésekkel szembeni korai gazdaválaszokhoz 1 . A vér monociták perifériás szövetekbe történő egyensúlyi felvételét és ezen sejtek lokális differenciálódását felgyorsítják a mikrobiális fertőzés során, lehetővé téve a makrofágok és dendritikus sejtek (DC) populációk gyors megújulását a baktériumok invázióján. A fertőzött szövetekben a monociták, makrofágok és DC-k együttesen járnak el a kórokozók felszámolásában a baktériumok internalizálásával, antimikrobiális faktorok előállításával, a gyulladást elősegítő citokinek felszabadításával és az adaptív immunválasz elősegítésével 2 . Ezért elengedhetetlen a korai monocita-toborzás a gazdaszervezet hatékony védelmére a különféle mikrobiális fertőzések ellen 3, 4, 5 . Ha nem gyorsan visszatartják, akkor a súlyos fertőzések az életképes baktériumok vérbe történő áthelyezésével járhatnak, ahol olyan akut, súlyos gyulladásos reakciót válthatnak ki, amely szepszishez vezet (szisztémás gyulladásos reakció szindróma vagy SIRS néven is ismert) 6 . Noha az emberi szepszis a morbiditást és a halálozást nagy teherrel hordozza szerte a világon, és évente több millió halálesetet okoz, az emberi monociták mikrobiális antigének általi aktiválása és az SIRS elősegítésének mechanizmusai az akut fertőzések során még mindig nem teljesen ismertek.

A monociták gyorsan szaporodnak a szepszisben szenvedő betegek keringésében és nagy mennyiségű proinflammatorikus citokint termelnek, beleértve az IL-1α / β, TNFa és IL-6-ot, a bakteriális lipopoliszacharidra (LPS) reagálva 7, 8, 9 . A szöveti rezidens sejtektől, például a makrofágoktól eltérően, a keringő monociták rendkívül gyors és robusztus választ mutatnak a bakteriális fertőzésekre. 1, 10, 11 . Ennek megfelelően a monocita differenciálódása makrofágokká jellemzően a gyulladást elősegítő citokinek szekretációs képességének csökkenésével jár együtt 12, 13, 14 LPS expozíció esetén. Mind a monociták, mind a makrofágok előállíthatják az erős „akut fázisú” IL-1β citokint, amely a szöveti sérülésekkel és a mikrobiális invázióval szembeni immunválasz fő szabályozója 15 . Bár az IL-1β erős védőhatást fejt ki a bakteriális fertőzés során, ennek a citokinnek a túlzott termelődése szeptikus sokkkal, deregulált gyulladásokkal és autoimmun patológiákkal is társul 15 .

Az IL-1β citokint inaktív prekurzormolekulaként (pro-IL-1β) állítják elő, amelyet érett formává kell alakítani, hogy funkcionálissá váljon. A pro-IL-1β feldolgozását a kaszpáz-1 enzim közvetíti, amelyet a multi-protein 'inflammaszóma' komplexek aktiválnak. Az gyulladásos megkülönböztetett NOD-szerű receptorok, mint például az NLRP1, NLRP3, NLRP6 és NLRC4 (ref. 16, 17, 18, 19). Makrofágokban és DC-kben az NLRP3 inflammaszóma aktiválásához két különálló jel szükséges; (i) egy indító inger, például az NF-κB út LPS által indukált aktiválása, amely növeli az NLRP3 és a pro-IL-1β transzkripcióját (20. hivatkozás), és (ii) egy második aktiválási jel, amely indukálja az a gyulladásos komplex pro-kaszpáz-1 és adapter-molekulák apoptózissal kapcsolatos speck-szerű fehérje toborzásán keresztül, amely kaszpáz-toborzási domént (ASC) tartalmaz. Csak akkor, ha mindkét esemény párhuzamosan fordul elő, a makrofágok és a DC-k kezdeményezhetik a kaszpáz-1 proteolitikus hasítását és közvetíthetik a pro-IL-1β érését aktív 21 citokinné. Ezzel szemben a monociták megkülönböztetett egylépéses gyulladásos aktiválódási utat mutatnak, amely csak a TLR4 stimulációjára reagálva, erőteljes IL-1β felszabadulást válthat ki anélkül, hogy másodlagos jelre lenne szükség 14 . Annak ellenére, hogy a gyulladásos aktiválás ezen monocita-specifikus mechanizmusának valószínűleg központi szerepe van az emberi szepszis patogenezisében, az LPS-stimulált humán monocitákban ennek az útnak a fő mediátorai jelenleg ismeretlenek.

Annak ellenére, hogy a LPS érzékenysége egérben három nagyságrenddel alacsonyabb, mint az embereknél, a gyulladásos aktiválás mechanizmusával kapcsolatos korábbi adatok többsége egér makrofágokban és DC-kben végzett vizsgálatokból származik, amelyeket nem lehet könnyen extrapolálni emberi betegek terápiás alkalmazásához . Valójában az emberi monocitákról úgy gondolják, hogy a szepszis patogenezisének kulcsfontosságú közvetítői, ám ezeknek a TLR4-t expresszáló sejteknek az LPS aktiválja a gyulladásgátló molekuláris mechanizmusait ismeretlen. A jelen jelentésben új kaszpáz-4/5-függő utat azonosítottunk, amely lehetővé teszi az emberi monociták számára, hogy az LPS-kezelést követően gyorsan felszabadítsák az IL-1α / β-t. Ezen új út terápiás célzása hasznos lehet akut és krónikus emberi gyulladásos rendellenességek esetén.

Eredmények

A humán monociták csak az LPS-re válaszul szabadítják fel az IL-1β-t

Az LPS stimuláció önmagában elegendő volt az IL-1α, IL-1β és IL-6 proinflammatorikus citokinek szekréciójának indukálásához (1a. Ábra), a pro-IL-1β prekurzor gyors szintéziséhez (1b ábra), az NLRP3 expressziójának szabályozásához (1c. Ábra), és a kaszpáz-1 (1d. Ábra) aktiválása az emberi monocitákban. A szokásos NLRP3-aktiváló ATP jel hozzáadása tovább fokozta a kaszpáz-1 hasítását az LPS-stimulált humán monocitákban (1d ábra), de ehhez a kiegészítő stimulushoz nem volt szükség az IL-1β jelentős felszabadulásának kiváltásához (1a. Ábra). Az NLRP3 szerepének felméréséhez az IL-1β felszabadulásában és a kaszpáz-1 feldolgozásában az LPS stimulációra adott válaszként az NLRP3 expresszióját specifikus siRNS duplexek segítségével monocitákban leütöttük (1e. Ábra). Az NLRP3 downreguláció szignifikáns csillapítást okozott az IL-1β szekrécióban (1f ábra) és a kaszpáz-1 feldolgozásban (1g ábra) a kontroll siRNS-hez viszonyítva. Az IL-6, egy gyulladásmentes független citokin felszabadulása azonban változatlan maradt (1f ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy önmagában az LPS expozíció képes aktiválni az NLRP3 gyulladást okozó emberi monocitákat, ami fokozza a pro-IL-1β prekurzor feldolgozását és az aktív IL-1β p17 későbbi felszabadulását.

Image

( a ) Az emberi monocitákat stimuláltuk vagy sem 10 ng ml −1 LPS-sel 1-16 órán keresztül (felső panelek), vagy 5 órán át aktiváltuk 0, 0001-10 μg ml −1 LPS-sel (alsó panelek). A válaszokat IL-1α, IL-1β és IL-6 felszabadulásnak a felülúszókba történő ELISA-mérésével elemeztük. ( b, c ) Pro-IL-1β, aktív IL-1β p17 ( b ) és NLRP3 ( c ) Western blot analízise LPS-sel stimulált monocitákban a megadott időtartamokra. A pro-IL-1β, IL-1β p17 és NLRP3 expressziót az összes sejt lizátumban értékeltük. ( d ) A pro-kaszpáz-1, a kaszpáz-1 p20 és a GAPDH Western blot analízise tápközegben tenyésztett monocitákban, önmagában LPS-ben vagy LPS-ben az ATP-vel kombinálva. ( e ) Kvantitatív valós idejű PCR-t használtunk az monociták NLRP3 transzkriptumainak siRNS-közvetített csökkenésének validálására. ( f ) IL-1β és IL-6 felszabadulás monocitákból, amelyekben az NLRP3 expressziója az siRNS alkalmazásával csökkent. második, nem észlelhető. ( g ) A kaszpáz-1 feldolgozását kontroll siRNS-sel (CTRL) vagy NLRP3 siRNS-sel kezelt és LPS-sel stimulált monocitákban Western blot módszerrel értékeljük. A blotok három független kísérlet képviselői. Az a és f grafikonok háromszoros mélyedések átlag ± sd értékét mutatják, és három vagy több független kísérletre vonatkoznak. Az e ábra három független kísérlet átlag ± sd-jét mutatja. A szignifikancia értékeléséhez egy mintás t- tesztet végeztünk. * P érték <0, 05.

Teljes méretű kép

Az NLRP3 gyulladásos aktiválásának mechanizmusa a monocitákban szignifikánsan eltér a teljesen differenciált makrofágokban és a DC-kben megfigyeltől. Ennek megfelelően, bár önmagában az LPS-expozíció képes volt jelzett IL-6 termelést kiváltani az emberi makrofágok és DC-k által (kiegészítő 1a., C. Ábra), ez az inger nem volt képes elősegíteni a kaszpáz-1 feldolgozását (kiegészítő 1b., D. Ábra) és az IL -1β szekréció (kiegészítő 1a., C. Ábra), kivéve ATP jelenlétében. Az emberi monociták tehát az NLRP3 gyulladásos aktiválásának alternatív módját mutatják, amely mechanikusan különbözik a jelenleg kialakult modelltől, amelyet elsősorban a makrofágokban és a DC-kben írnak le.

Az LPS indukálja a kaszpáz-5 feldolgozását az emberi monocitákban

Az egér gyulladásos kaszpáz-1 és -11 in vivo szepszis sokk nélkülözhetetlen mediátorjai. A legfrissebb tanulmányok a kaszpáz-11-et is azonosították a nem-kanonikus gyulladáscsökkentő aktiválás egyik fő szabályozójaként, amely az IL-1α felszabadulásáért felelős az intracelluláris LPS-re és a Gram-negatív baktériumokra reagálva, valamint a gyulladásos eredetű sejtek elhalálozásának egyik meghatározó tényezõje 25, 26, 27 .

Az egér kaszpáz-11 feltételezett humán ortológjai az kaszpáz-4 és -5, az aminosav-szekvencia alapján. A kaszpáz-4/5 expressziójának és aktiválásának, valamint a kaszpáz-4/5 által mediált gyulladásos aktiválás aktiválásának mechanizmusainak jelenlegi ismerete továbbra is korlátozott. Ezért úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk ezen kaszpázok szerepét az IL-1 útvonalában az LPS-stimulált monocitákban.

Először a kaszpáz-4 és -5 expresszióját vizsgáltuk humán monocitákban egyensúlyi állapotban és LPS kezelés után. A kaszpáz-4 és -5 mRNS expressziója 3 stimuláció után 3 órával növekedett, amikor az LPS 18 óra elteltével alapszintre csökkent (2a., B. Ábra), míg a fehérje szintje változatlan maradt (2c – f. Ábra).

Image

( a, b ) A kaszpáz-4 és -5 mRNS expresszióját LPS-vel kezelt monocitákban (10 ng ml −1 ) a megadott időpontokra kvantitatív valós idejű PCR-rel mértük. ( c ) A kaszpáz-4 (pro-forma és hasított p20) Western blot analízise 5 n órán át stimulált monociták sejtlizátumában 10 ng ml −1 LPS-sel. ( d - f ) A pro-kaszpáz-5 és a kaszpáz-5 p20 Western blot elemzése monocitákban, növekvő LPS-koncentrációval (0, 0001–10 μg ml −1 ) stimulálva ( d ) vagy az LPS rögzített koncentrációja (10 ng ml −1) ) változó időtartamra ( e ). ( f ) A kaszpáz-5 feldolgozását Western reprezentatív elemzéssel értékeljük három reprezentatív donor monociták lizátumában LPS (10 ng ml −1 ) után 5 órán át. GAPDH-t használtunk betöltési kontrollként. A blotok három független kísérlet képviselői.

Teljes méretű kép

A kaszpáz-4 szabályozással ellentétben a monociták LPS stimulálása indukálta a pro-kaszpáz-5 feldolgozását, amint azt p20 alegységének dózis- és időfüggő megjelenése tükrözi (2d, e ábra). A kaszpáz-5 feldolgozása következetes volt a különböző donorok között (2f ábra). Mivel a kaszpáz-5, de nem a kaszpáz-4 feldolgozása ment keresztül, az LPS úgy tűnik, hogy indukálja a nem konvencionális kaszpáz-5 feldolgozást az emberi monocitákban.

Az LPS által közvetített IL-1 felszabadulás a monociták kaszpáz-4/5-től függ

Ezután megvizsgáltuk, hogy a kaszpáz-4 és / vagy -5 szabályozza-e a gyulladásgátlóval aktivált IL-1α és IL-1β szekrécióját az emberi monocitákban az LPS-nek való kitettség után. Először azt határoztuk meg, hogy szükség van-e kaszpáz-4/5 aktivitásra a citokin felszabadulásához. A monocitákat előkezeltük a LEVD-fmk inhibitorral, amely az LPS stimuláció előtt blokkolja mind a kaszpáz-4, mind az -5 aktivitását. Az IL-1α és IL-1β felszabadulása szignifikánsan romlott, amikor a tenyészetbe hozzáadtuk a LEVD-fmk inhibitort, míg a Z-YVAD-fmk kaszpáz-1 inhibitor csak az IL-1β felszabadítását gátolta (3a. Ábra). Az LPS által kiváltott monociták IL-6 felszabadulása stabil maradt a LEVD-fmk inhibitor jelenlétében (3a. Ábra), jelezve, hogy az inhibitor nem volt toxikus.

Image

( a ) A monocitákat vagy Z-YVAD-fmk-vel (kaszpáz-1 inhibitor), vagy LEVD-fmk-vel (kaszpáz-4/5 inhibitor) kezeltük 1 órán keresztül az LPS stimuláció előtt. A tenyészet felülúszóját 5 óra elteltével összegyűjtöttük, és az IL-1α, IL-1β és IL-6 szekrécióját ELISA-val határoztuk meg. ( b, e ) A kaszpáz-4 ( b ) vagy a kaszpáz-5 ( d ) elnémulását Western blot módszerrel határoztuk meg az LPS-sel stimulált siRNS-kezelt monocitákban. GAPDH-t használtunk terhelés-szabályozásként. Megmutattuk a pro-kaszpáz-5 és a kaszpáz-5 p20 denzitometriás elemzését is. ( c, e ) A citokinek felszabadulását az siRNS-kezelt monocitákból az LPS stimuláció után ELISA-val értékeltük. A blotok három független kísérlet képviselői. A grafikonok három párhuzamos lyuk átlag ± sd-jét mutatják, és három vagy több független kísérletre vonatkoznak. * P érték <0, 05, ** P érték <0, 01.

Teljes méretű kép

A kaszpáz-4 és -5 egyéni szerepének további ellenőrzése érdekében az IL-1α és IL-1β felszabadulásban siRNS-eket használtunk ezen kaszpázok expressziójának monocitákban történő leütésére. A kaszpáz-4 siRNS duplexek hatékonyan elnyomják a kaszpáz-4 mRNS-t és a fehérjét (kiegészítő 2a. És 3b. Ábra), de nem kaszpáz-1 vagy -5 mRNS-t (kiegészítő 2a. Ábra). A kaszpáz-4 elnémítása szignifikánsan elnyomta az IL-1α és IL-1β, valamint az IL-6 felszabadulását az LPS-kezelt monocitákból (3c. Ábra). Ezek az eredmények, amelyeket négy független donortól szereztek (kiegészítő 2b. Ábra), megerősítik a kaszpáz-4 szerepét a citokinek LPS által közvetített felszabadulásában, ideértve azokat is, amelyek nem igényelnek gyulladásos aktiválást, mint például az IL-6. Az a tény, hogy az IL-6 szekréciója szintén csökkent a kaszpáz-4-hiányos monocitákban, arra utal, hogy a kaszpáz-4 részt vehet az NF-κB-mediált géntranszkripcióban, amint azt Lakshmanan et al . 28 THP1 sejtekben. A farmakológiai inhibitor alkalmazásával nyert adatok azonban azt mutatják, hogy az IL-6 felszabadulása nem függ a kaszpáz-4 aktivitásától.

Az siRNS-közvetített elnémításkor a kaszpáz-5 expressziója lényegesen csökkent az emberi monocitákban mind fehérje (3d. Ábra), mind mRNS szint mellett (kiegészítő 2c. Ábra), míg a kaszpáz-1 és a kaszpáz-4 expressziója változatlan maradt. A pro-kaszpáz-5 elnémítása egybeesett a casp-5 p20 redukciójával, amit Western blot-elemzéssel (3d. Ábra), valamint az IL-1α és az IL-1β jelentős elnyomásával monocitákból mutattak LPS stimuláció után (3e. Ábra). A kaszpáz-4 elnémításával ellentétben a kaszpáz-5 siRNS duplexek nem mutattak szignifikáns hatást az IL-6 termelésére (3e. Ábra). Ezeket az eredményeket három független donortól származó monocitákban (kiegészítő 2d. Ábra) igazoltuk, akár egyszemélyes, akár egyesített siRNS duplexek alkalmazásával (kiegészítő 2e., F. Ábra).

Az NLRP3 a kanonikus ingerek által kiváltott kaszpáz-1 aktiválás nélkülözhetetlen tényezője 17 . Mivel korábban bebizonyítottuk, hogy az LPS NLRP3-függő módon indukálta a kaszpáz-1 feldolgozást (1g. Ábra), aztán megpróbáltuk meghatározni, hogy a nem-kanonikus kaszpáz-4 és -5 hozzájárul-e a kaszpáz-1 aktiválásához az LPS stimulációt követően. Megállapítottuk, hogy sem a kaszpáz-4, sem a kaszpáz-5 nem változtatta meg szignifikánsan a kaszpáz-1 feldolgozását az LPS-stimulált monocitákban (3b, d ábra). Ez az eredmény azt jelzi, hogy az NLRP3-függő útvonala a legfontosabb tényező a kaszpáz-1 aktiválásában.

Nemrégiben a kaszpáz-4 részt vett a sejthalál indukciójában. Annak meghatározására, hogy a kaszpáz-5 hasonlóan részt vesz-e az LPS által kiváltott sejthalálban, stimuláltuk a monocitákat LPS-sel 5 és 24 órán keresztül, és megmértük a laktátdehidrogenáz (LDH) felszabadulását a sejtmentes felülúszókban. A kezeletlen és LPS-stimulált monociták hasonló szintű LDH-t szabadítottak fel (Kiegészítő 3a. Ábra). Ezeket az eredményeket, amelyeket annexin V, 7AAD festéssel és áramlási citometriával erősítettünk meg (kiegészítő 3b. Ábra), azt jelezzük, hogy a monociták nem állnak ellen az LPS által kiváltott sejthalálhoz, amint azt mások is beszámolták 31, 32 .

Az IFNAR útvonal nélkülözhetetlen a kaszpáz-5 feldolgozásához

Mivel az LPS kaszpáz-5-et váltott ki, de a kaszpáz-4-feldolgozást nem, megvizsgáltuk, melyek a kaszpáz-5 aktivációját szabályozó upstream mechanizmusok. Korábbi tanulmányok szerint a kaszpáz-11 expressziója egér makrofágokban I típusú interferonokat (IFN) igényel, 33, 34, 35 . Először megvizsgáltuk, hogy az autokrin IFN-β jelátvitel hozzájárulhat-e a kaszpáz-5 aktiválásához, mivel az emberi monociták az IFN-β magas szintjét választják el az LPS stimuláció során. A rekombináns IFN-β nagy dózisai, akár önmagában, akár LPS-sel kombinálva, az interferon-stimulált gének (ISG-k) kifejezett expresszióját indukálták (kiegészítő 4a. Ábra), ám a kaszpáz-5 expresszióját vagy feldolgozását nem sikerült növelni (5. ábra). 4a-d). Ennek megfelelően az IL-1α, IL-1β és IL-6 LPS által kiváltott monocita-felszabadulását exogén IFN-β citokin hozzáadásával nem befolyásolta (4e. Ábra). Ezen adatokkal összhangban az IFN-α / β receptor (IFNAR) antitest semlegesítése potenciálisan csökkentette az ISG expressziót (kiegészítő 4b. Ábra), de nem csökkentette az LPS által indukált kaszpáz-5 feldolgozást (4f. Ábra, 2. sáv és 6. sáv). vagy citokin felszabadulás (4g ábra). Ezek az adatok azt jelzik, hogy az IFNAR útvonal nem váltja ki kaszpáz-5 aktivációt az LPS-nek kitett monocitákban, kiemelve az emberi és az egér ortológjai szabályozásának jelentős eltéréseit.

Image

( a - d ) A kaszpáz-5 kvantitatív valós idejű PCR ( a, c ) és Western blot analízise ( b, d ) monocitákban, amelyeket különböző időpontokban csak IFN-β-val kezeltek ( a, b ) vagy LPS-sel kombinálva ( c, d ). ( e ) IL-1a, IL-1β és IL-6 felszabadulása monociták által, amelyeket önmagában LPS-sel vagy IFN-β-val kombinálva kezelnek 5 órán át. ( f, g ) A monocitákat előzetesen semlegesítő anti-IFNAR (α-IFNAR) antitesttel vagy izotípushoz illesztett kontroll antitesttel (mIgG2a) kezeltük, majd csak IFN-β, LPS önmagában vagy IFN-β és LPS együttesen stimuláltuk. 5 órán át. ( f ) A kaszpáz-5 feldolgozását Western blot módszerrel (balra) értékeltük. A kaszpáz-5 p20 denzitometriás elemzését szintén megmutattuk (jobbra). ns, nem szignifikáns. ( g ) A citokin felszabadulását ELISA módszerrel vizsgáltuk. A blotok reprezentatívak két vagy több független kísérletre. A grafikonok három párhuzamos lyuk átlag ± sd értékét mutatják, és három független kísérletre vonatkoznak.

Teljes méretű kép

Az LPS internalizálása szükséges a kaszpáz-5 aktiválásához

Adataink azt mutatták, hogy az LPS-stimulált humán monocitákban a kaszpáz-5 aktivációja különféle mechanizmusokat alkalmaz, mint azok, amelyek az egér kaszpáz-11-t aktiválják. Ezért arra törekedtünk, hogy azonosítsuk a jelző eseményeket, amelyek közvetítik a kaszpáz-5 feldolgozását és az IL-1α / β felszabadulását az emberi sejtekből. Az immunsejtek az LPS-t a Toll-szerű 4-es receptoron (TLR4) keresztül érzékelik. Annak vizsgálatához, hogy szükséges-e TLR4 a kaszpáz-5 feldolgozásához, a monocitákat előzetesen inkubáltuk a Rhodobacter sphaeroides (LPS-RS) LPS- sel az LPS stimuláció előtt. Az LPS-RS a patogén baktériumok LPS hatékony antagonistája és elnyomja a TLR4 jelátvitelt az emberi sejtekben 36 . Megállapítottuk, hogy a TLR4 blokkolása az LPS-RS segítségével hatékonyan elnyomja a kaszpáz-5 LPS által indukált feldolgozását (Kiegészítő 5a. Ábra).

Az LPS tartalmazza a lipid A csoportot, a mag oligoszacharidot és az O-antigént, a változó hosszúságú 37 poliszacharidot. Bár az LPS mutánsok aktiválják a TLR4-et, eltérő veleszületett immunválaszokat váltanak ki. Közelebbről, az LPS-Re mutáns, amelyben hiányzik a szacharid O-lánc, és a lipid A csoport, aktiválja a MyD88 utat, függetlenül a CDR TLR4 társreceptorától (38. hivatkozás). Ezért teszteltük az LPS-Re mutáns vagy a lipid A képességét a kaszpáz-5 feldolgozásának indukálására. Megállapítottuk, hogy a kaszpáz-5 p20 feldolgozása szignifikánsan csökkent a lipid A-val stimulált monocitákban, de nem az LPS-Re-ben, amely képes a CD14-en keresztül hatni, összehasonlítva az ép LPS-rel (5b. Kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a TLR4 jelátvitelre szükség van a kaszpáz-5 feldolgozásához, és arra utalnak, hogy a CD14 részben részt vehet.

Az LPS-TLR4 bekövetkezését követõ egyik elsõ esemény a receptor-ligandum komplex beépítése az endoszomális rekeszekbe 39 . Az LPS-TLR4 endoszómákba juttatásához a CD14 TLR4 ko-receptor és a Syk 40, 41 tirozinkináz szükséges. Ezért feltételeztük, hogy a kaszpáz-5 aktiválás az SPS által közvetített LPS-indukált CD14 / TLR4 internalizáció fiziológiás folyamata révén fordulhat elő. Megállapítottuk, hogy a monociták LPS-stimulációjakor a CD14 / TLR4 komplexek a Rab5 + korai endoszómáira lokalizálódnak egy folyamatot igénylő dinamint igénylő folyamat során. Valójában a monociták előzetes kezelése a specifikus dinamin-inhibitorral, a dynasore-zal megakadályozta a CD14 / TLR4 internalizálódását (Kiegészítő 6a., B. Ábra). Az endotoxin eloszlás elemzése rávilágított arra is, hogy az LPS nagyon korai időpontban (1 perc) lokalizálódott a plazma membránban, majd gyorsan internalizálódott (Kiegészítő 6c. Ábra). Meglepő módon az LPS internalizálása a későbbi időpontokban (> 1 óra) nem eredményezett együttes lokalizációt sem a korai, sem a késői endocitikus markerekkel, ehelyett diffúz eloszlást mutattak, amely a citoszolos lokalizációra utal (Kiegészítő 6d. Ábra).

Ezután teszteltük a Syk követelményét a folyamat közvetítésében. Az LPS-mel végzett monocita stimuláció Syk gyors foszforilációját indukálta az emberi monocitákban, mely jelentősen csökkent az LPS-Re- és lipid A-val kezelt monocitákban (5a, b ábra). A Syk-aktivitás farmakológiai gátlása az R406 alkalmazásával megszakította a CD14 / TLR4 internalizációját (Kiegészítő 7a., B. Ábra). Hipotézisünkkel összhangban az LPS endocitózisának a Syk vagy a dinamin aktivitással történő megzavarása jelentősen csökkentette a kaszpáz-5 hasítását (5c, d ábra), és következésképpen befolyásolta az IL-1β és IL-1α felszabadulását (5e, f ábra). . Az IL-6 felszabadulása, amely megköveteli a TLR4 jelátvitelt a plazmamembránról, normál esetben a dynasore- és R406-kezelt monocitákban zajlott (5e, f ábra). Ezek az adatok bizonyítják, hogy az LPS endocitózis szükséges és elegendő ahhoz, hogy indukálja a kaszpáz-5 aktivációját és IL-1β és IL-1a felszabadulását az emberi monocitákból.

Image

( a, b ) p-Syk (Tyr 525–526) vagy összes Syk Western blot elemzése monocitákban, amelyeket kezeletlenül hagytak (UT), vagy stimuláltak LPS-sel, LPS-RE-vel vagy A lipiddel a megadott időpontokban. ( c, d ) A kaszpáz-5 és a kaszpáz-5 p20 Western blot elemzése monocitákban, amelyeket 1 órán át előkezeltünk a Syk inhibitorral R406 (0, 5–2 μM) ( c ) vagy a dinamin-inhibitor dynasore-nal (40–80 μM). ( d ) előzetes stimulálás LPS-sel 5 órán keresztül. A blotok három független kísérlet képviselői. A caspase5 p20 denzitometriás elemzése is látható (jobbra). ( e, f ) IL-1α, IL-1β és IL-6 felszabadulása az R406 ( e ) -vel vagy dynasore-nal ( f ) előkezelt monocitákból az LPS stimuláció előtt. Az ( e, f ) grafikonok három párhuzamos lyuk átlag ± sd értékét mutatják, és három független kísérletre vonatkoznak. A ( c, d ) (jobb oldali) grafikonok három független kísérlet átlag ± sd-jét és szignifikanciáját mutatják egy t- teszt alkalmazásával kiértékelve. * P érték <0, 05, ** P érték <0, 01.

Teljes méretű kép

A kaszpáz-5 aktiválása a Ca 2+ mobilizációjától függ

A CD14 / TLR4 endocitózisban betöltött szerepén kívül a Syk a lektinreceptorok után is működik, hogy elősegítse a pro-IL-1β szintézisét és a reaktív oxigénfajok (ROS) képződését. A ROS-termelés viszont az NLRP3 gyulladásos aktiválásához és az érett IL-1β 42 citokin felszabadításához vezet. Ezért megvizsgáltuk, hogy a ROS hozzájárul-e az LPS által indukált kaszpáz-5 aktivációhoz humán monocitákban. Az LPS expozíció erőteljesen megnövelte a ROS monocitatermelését, amelyet a Syk-aktivitás gátlása követte (6a. Ábra). Érdekes módon a DPI ROS-gátló hatékonyan elnyomta a kaszpáz-1 aktivitást, de nem befolyásolta a kaszpáz-5 feldolgozását (6b. Ábra). A ROS szintézis farmakológiai gátlása szintén csökkentette az IL-1β monocita szekrécióját, az IL-1a azonban nem (6c. Ábra). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a ROS nélkülözhetetlen a kaszpáz-5 aktiválásához és az IL-1a felszabadításához, ami arra utal, hogy ezen útvonal további mediátorjaira is szükség lehet.

Image

( a ) Az RPS termelődést az R406 Syk inhibitorral előkezelt monocitákban meghatározzuk az LPS stimuláció előtt. ( b, c ) A monocitákat előkezeltük DPI inhibitorral az LPS stimuláció előtt. A kaszpáz-1 és a kaszpáz-5 aktiválódását ( b, balra) Western blot módszerrel határoztuk meg. A Blot négy független kísérlet képviselője. A kaszpáz-5 p20 denzitometriás elemzését négy független kísérlet átlag ± sd-ként mutatjuk be, és a szignifikanciát egy minta t- tesztje alapján értékeltük ( b, jobbra). ( c ) Az IL-1α és IL-1β felszabadulását ELISA-val határoztuk meg. Az ( a, c ) grafikonok megmutatják a három párhuzamos lyuk átlag ± sd értékét, és három független kísérletre vonatkoznak. ** P érték <0, 01, ns nem szignifikáns.

Teljes méretű kép

Syk alapvető szerepet játszik a PLCy-mediált Ca 2+ -mobilizáció szabályozásában is. A Syk által közvetített PLCγ aktiválás inozitol 1, 4, 5-trifoszfát (IP3) képződését eredményezi, amely az endoplazmatikus retikulumban a receptorához való kötődésével provokálja a Ca2 + felszabadulását a 43, 44 citoszolba. Ezért megvizsgáltuk a Ca 2+ szerepét az LPS által kiváltott egylépéses gyulladásos aktiválás során. Először megerősítettük, hogy a Syk és a PLCy aktivitás gátlása megsemmisítette a Ca2 + fluxust LPS-stimulált monocitákban (7a. Ábra). A Ca 2+ mint a kaszpáz-5 aktiválásának lehetséges második hírvivő szerepének felmérése céljából a monocitákat előzetesen kezeljük egy sejtáteresztő intracelluláris Ca 2+ kelátorral (BAPTA / AM), egy extracelluláris Ca 2+ kelátorral (EGTA), vagy permeábilis IP3 receptor antagonista (2-APB), az LPS-sel történő stimulálás előtt. Megfigyeltük, hogy a kaszpáz-5 feldolgozása (7b, c ábra), valamint az IL-1β és IL-1a felszabadulása (7d, e ábra) a Ca2 + mobilizációjától függ.

Image

A monocitákat előkezeltük az R406 ( a ) Syk inhibitorral, az U73122 PLCγ inhibitorral ( a, b ), az EGTA Ca2 + kelátjaival (0, 5 és 2 mM, membrán nem áteresztő) vagy BAPTA-val (2, 5 és 10 μM, membránpermeant). ) ( b, d, e ) és az IP3 receptor antagonista 2-APB (50 és 100 μM) ( c - e ) az LPS stimuláció előtt. A válaszokat Ca2 + -mobilizáció ( a ), a kaszpáz-5 ( b, c ) aktiválásának, valamint az IL-1a és IL-1β ( d, e ) felszabadulásának mérésével elemeztük. A blotok három független kísérlet képviselői. A ( b, c ) pontban a kaszpáz-5 p20 denzitometriás analízisét mutatjuk be három független kísérlet átlag ± sd-ként. A szignifikancia egy minta t- próba segítségével kerül kiértékelésre. Az a) panelen lévő nyilak jelzik a HBSS vagy az LPS hozzáadásának időpontját. Az ( a, d, e ) grafikonok megmutatják a három párhuzamos lyuk átlag ± sd értékét, és három független kísérletre vonatkoznak. * P érték <0, 05, ** P érték <0, 01, ns nem szignifikáns.

Teljes méretű kép

Végül megvizsgáltuk, hogy a makrofágok és a DC-k képtelenek-e bekapcsolni a nem konvencionális egylépéses gyulladásos utat az endotoxin expozícióra adott válaszként, mert ezek a sejtek különböző válaszokat mutatnak az LPS-re. A monociták magas szintű CD14-et expresszálnak, de ha in vitro differenciálódnak makrofágok és DC-k között, akkor CD14 alacsony / negatívvá válnak (Kiegészítő 8a. Ábra). Bár a makrofágok és a DC-k megtartják az LPS-re való reagálás képességét, és számos stimulációs válaszként felszabadítják a gyulladásos tényezőket, a CD14 expressziójának hiánya a Syk-út aktiválásának képtelenségét eredményezi (Kiegészítő 8b. Ábra). Valójában, bár az LPS indukálta a Syk foszforilációját a monocitákban, a makrofágokban és a DC-kben nem volt képes erre (kiegészítő 8b. Ábra). Ezenkívül az LPS nem indukálta a Ca2 + -mobilizációt az in vitro differenciált makrofágokban és DC-kben, bár ezek a sejtek normálisan reagáltak az ATP-expozícióra (Kiegészítő 8c. Ábra), megmutatva, hogy képesek mobilizálni a Ca2 + -ot . A hibás Ca 2+ jelátvitel a makrofágokban és a DC-kben alapul szolgálhat azon képességükön, hogy nem tudják bekapcsolni ezt az utat az LPS-re adott válaszként. Meglepő módon az LPS kaszpáz-5 hasítást indukált, amely p20 alegységet hoz létre makrofágokban és DC-kben (8d. Ábra). Érdekes, hogy a monocitákban következetesen megfigyeltük körülbelül 10–12 kDa kaszpáz-5 feldolgozott formájának jelenlétét, amelyet a DC-kben és a makrofágokban nem detektáltunk LPS és LPS / ATP stimuláció hatására (Kiegészítő 8d. Ábra). A kaszpáz-5 e feldolgozott formája az idő múlásával és az LPS növekvő dózisaival megjelent; kialakulását Syk, dinamin és PLCγ inhibitorok, valamint monocita előkezelés gátolta intracelluláris (BAPTA / AM) vagy extracelluláris (EGTA) Ca 2+ kelátokkal vagy IP3 receptor antagonistával (Kiegészítő 9a – f. ábra). A 10–12 kDa-os feldolgozott kaszpáz-5 forma jelenléte minden körülmények között ugyanazt a kaszpáz-5 p20 mintázatot mutatta (kiegészítő 9. és 11. ábra).

A 10–12 kDa-os feldolgozott kaszpáz-5 forma nem képviseli a kaszpáz-5 kis p10 alegységét, mivel a vizsgálatunkban alkalmazott ellenanyag csak a nagy p20 alegységet detektálja. Ezért proteomikus megközelítést alkalmaztunk eredete azonosítására. A kaszpáz-5 fehérjét 1 órán keresztül tandem tömegcímkével jelöltük, amelyek módosítják a primer aminokat, ideértve az endopeptidáz hasítás eredményeként származó szabad N-terminálisot is. Ez a módszer lehetővé tette a kaszpáz-5-en hasított helyek megjelölését és felismerését a tripszin emésztése előtt. Tömegspektrometriával azonosítottuk a DMESVLR peptidet (amely megfelel a 240–246 aminosavaknak), amely a kaszpáz-5 p20 középső részét jelöli (Kiegészítő 10. ábra). A DME motívum ugyanazokkal a fizikai és biokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint a kaszpáz-1-ben azonosított konszenzushasítási szekvencia, amelyhez P1-helyzetben aszparaginsavra (D) van szükség. Ez az újonnan azonosított hasítási hely a kaszpáz-5 p20 alegység közepén helyezkedik el, és két peptidet generál, körülbelül 10–12 kDa molekulatömegű. Az egyik peptid a kaszpáz-5 aktív helyét tartalmazza (az a) izoform 315 cisztein), míg a másik a Leu146-ot tartalmazza, amelyet az antitest felismer (10a. Ábra). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a D137-R239 peptid származhat a kaszpáz-5 p20 feldolgozásából.

Összegezve, ezek az eredmények azt sugallják, hogy a kaszpáz-5 p20 feldolgozásához és további hasításához a D137-R239 peptidké szükséges a monocitákban a Syk / PLCy-indukált Ca 2+ fluxus. Ez összhangban van a nem konvencionális gyulladásos út aktiválásával LPS-stimulált monocitákban.

Vita

A monociták a legelterjedtebb CD14 / TLR4-expresszáló sejttípusok az emberi keringésben, és döntő szerepet játszanak az 1, 7 szepszisben. Az LPS monocita aktiválását indukáló molekuláris mechanizmus azonosítása tehát fontos klinikai következményekkel jár. Jelentettük, hogy a kaszpáz-5, akárcsak a kaszpáz-4, hozzájárul a TLR4-mediált IL-1α / β felszabadulásához az emberi monocitákból.

A fehérje szekvencia alapján a kaszpáz-4 és -5 osztályozódik az egér kaszpáz-11-hez leginkább homológ gyulladásos kaszpázokként. Lehetséges, hogy a gyulladásos aktiválás különféle mechanizmusai fejlődtek ki különböző fajokban és különböző sejttípusokban. Jelenleg nincs egyetértés abban, hogy a két kaszpáz közül melyik képviseli az egér kaszpáz-11 funkcionális ortológját.

A kaszpáz-4-et pyroptotikus sejthalállal társították mono-mielocita sejtvonalakban (THP1, U937), amelyet intracelluláris LPS-leadás indukált 29 . Ezen túlmenően, az emberi kaszpáz-4 transzgenikus expressziója egerekben elősegítette a kaszpáz-1 aktivációját és fokozta az IL-1β / IL-18 felszabadulását az LPS 45-re adott válaszként. Egy nemrégiben elvégzett tanulmány kimutatta, hogy a kaszpáz-4 hozzájárul a gyulladásgátló aktivációhoz és az IL-1α, az IL-1β felszabadulásához azonban az emberi makrofágokból, amikor Gram-negatív baktériumokkal fertőzött 30 . További bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy bár a kaszpáz-4 nem megy át feldolgozáson, közvetíti mind az IL-1α, mind az IL-1β szekrécióját, amelyet az LPS stimuláció indukál. Ezek az adatok, a Shi és munkatársai által közzétett eredményekkel együtt. A 29. ábra azt jelzi, hogy a kaszpáz-4 prekurzor nemcsak az LPS-hez kötődik, hanem funkcionálisan aktív is. Megállapítottuk, hogy az IL-6 LPS-indukálta felszabadulása a kaszpáz-4-hiányos monocitákból is befolyásolja, ami arra utal, hogy más citokinek és kemokinek, amelyeket az LPS-közvetített NF-κB aktiváció szabályoz, szintén szükség lehet kaszpáz-4-re. Valójában Lakshmanan és társai korábbi tanulmánya. A 28. számú beszámoló szerint a humán kaszpáz-4-hiányos THP1 sejtek a CXCL8, CCL4, CCL20 és IL-1β LPS által kiváltott szekréciójának jelentős csökkentését mutatták. Kimutatták, hogy az LPS által indukált NF-κB nukleáris transzlokáció és aktiválás a kaszpáz-4-től függ, annak kölcsönhatása révén a TNFR-hez kapcsolódó 6 faktorral (TRAF6).

Kevés információ áll rendelkezésre a kaszpáz-5-ről, annak aktiválásának mechanizmusairól és élettani funkcióiról. A kaszpáz-5 elsősorban a kórokozókkal szorosan érintkező szövetekben, például a bőrben expresszálódik . A kaszpáz-5-et korábban még nem befolyásolták a mikroorganizmusokra adott gazdaszervezet válaszában, mivel a korai vizsgálatok azt sugallták, hogy ez az enzim valójában az NLRP1 gyulladásos anyag 48 alkotóeleme, és hogy főként hozzájárult a 49, 50 apoptózis indukciójához. A kaszpáz-5 specifikus aktiváló ingerei és célszubsztrátjai eddig homályosak maradtak. Vizsgálatunkban a kaszpáz-4 és -5-et azonosítottuk az emberi monociták LPS-aktiválásának kritikus downstream célpontjaival. Megállapítottuk, hogy a kaszpáz-5 hozzájárul az IL-1α és IL-1β, az IL-6 nem szabadul fel az LPS-stimulált monocitákból.

Sőt, bár bár a kaszpáz-4 és az -5 szabályozza az IL-1β felszabadulását a monocitákból az LPS stimuláció után, bizonyítékaink szerint az NLRP3 továbbra is a kaszpáz-1 aktiválásának fő szereplője. További vizsgálatokra van szükség a kaszpáz-4 és -5 exkluzív és egymást átfedő szerepének boncolásához, valamint a kanonikus NLRP3 gyulladásos aktivációban való részvételükhöz.

Érdekes módon a kaszpáz-5 p20 alegység mellett további 10–12 kDa fragmentumot azonosítottunk tömegspektrometriás elemzéssel, amely a p20 alegység közepén lévő hasítási helyből származik, amely a katalitikus helyet tartalmazza. A kaszpáz-5 10–12 kDa-os feldolgozott formájának jelenléte erősen korrelált a monociták azon képességével, hogy aktiválja a nem konvencionális egylépéses gyulladásos utat és az IL-1α / β felszabadítását csak az LPS-en keresztül tegye lehetővé. Valójában folyamatosan jelen van az LPS-stimulált monocitákban (9. és 11. kiegészítő ábra), de nem azokban a sejtekben, amelyek nem képesek az NLRP3 gyulladáscsökkentő képességét önmagában az LPS-sel aktiválni [makrofágok és DC-k (8.d kiegészítő ábra)]. Figyelembe véve azt a tényt, hogy a kaszpáz-5 feldolgozott D137-R239 formája tartalmazza a katalitikus helyet, a jövőbeni vizsgálatokban érdekes lenne megbecsülni, hogy aktivitása megmarad-e; bár a kaszpáz-5 szubsztrátjaival kapcsolatos ismeretek hiánya ezt a feladatot rendkívül megnehezíti.

Egerekben a nem-kanonikus gyulladásos utat kaszpáz-11 szabályozza, amelyet az LPS kénytelen bejuttatása a citoplazmába nem fiziológiás eszközökkel, például koleratoxin-B-közvetített bejuttatással, elektroporációval vagy lipofekcióval valósít meg: 26, 27, 29 . Ez a nem kanonikus gyulladásos út a TLR4-től független, és a gyulladásos kaszpáz-11 aktivációjához vezet, amely elősegíti a piroptózist és az IL-1a felszabadulását 26, 27, 29 . Kutatásainkban az exogén LPS a TLR4 jelátvitel útján citokin felszabadulást vált ki, de monocitákban sejthalál nem következik be. Ezek az eredmények összhangban állnak a korábbi jelentésekkel, amelyek azt mutatják, hogy a monociták spontán apoptózison mennek keresztül a tenyésztés során, és hogy az aktiváló ingerek (azaz LPS, GM-CSF, M-CSF, TNFα és IL-1β) meghosszabbítják a monociták in vitro túlélését . 31, 51, 52 . Az aktiválás által közvetített túlélés fiziológiai szempontból elengedhetetlen a monociták funkcionális integritásához, lehetővé téve a sejtek számára, hogy azonnal reagáljanak a különféle sértésekre (vagyis a mikrobákra). A citokinek felszabadulása és a sejthalál indukciója közötti hasonló eltérési pontot nemrégiben írták le az egér neutrofileiben a Gram-negatív baktériumokra adott válaszként 53, és érdekes lenne megvizsgálni a kaszpáz-11/4/5 lehetséges hozzájárulását a neutrofilek. Nem zárhatjuk ki azonban azt, hogy a kaszpáz-4 és / vagy a kaszpáz-5 szerepet játszhat a piroptózisban, ha más sejtrendszert és / vagy triggert használunk. További vizsgálatokra lesz szükség a kaszpáz-4 és -5 szerepének tisztázására a monocita sejthalálban.

Kimutatták, hogy a kaszpáz-11, valamint a humán kaszpázok-4 és -5 közvetlenül érzékeli az intracelluláris LPS-t és kiválthatja az önaktivációt 29 . Ezekben a vizsgálatokban azonban az LPS stimulus elektroporációval érkezett makrofágokba, amelyeket poli (I: C) (TLR3 agonista) előkezelt, és nem fordult elő a TLR4 által közvetített endocitikus útvonalon. Vizsgálatunkban az emberi monocitákat az LPS extracelluláris hozzáadásával aktiváltuk anélkül, hogy mesterséges módszereket alkalmaztunk az LPS citoszolba juttatására. Ezt a megközelítést alkalmazva megfigyeltük, hogy az LPS azonnal lokalizálódik a plazmamembránon, és a monociták a hagyományos endocitikus utakon keresztül gyorsan internalizálódnak. Az LPS internalizálását Syk szabályozta, és ennek a tirozin-kináznak a gátlása negatívan befolyásolta a kaszpáz-5 feldolgozását és az monociták IL-1α / β felszabadulását. A fiziológiás LPS felvétel kritikus jelentőségét a dinamin által közvetített endocitózis gátlása utáni csökkent monocita aktiválás is bizonyította.

Kutatásunk előtt Sykről már ismert volt, hogy részt vesz a kaszpáz-1 aktiválásában (42. hivatkozás), de az enzim új szerepéről, amelyet a kaszpáz-5-mediált aktivációban azonosítottuk, korábban nem számoltak be. Itt megmutattuk, hogy a kaszpáz-5 feldolgozásához és a citokin felszabadításához Syk-mediált Ca2 + fluxumra van szükség PLCγ / IP3 receptoron keresztül. A Syk-et a CD14 bekapcsolása aktiválja az LPS 41 által . Konzisztensen azt tapasztaltuk, hogy csak a CD14-et bevonó LPS-molekulák aktiválják a Syk és a kaszpáz-5 feldolgozását monocitákban. Csábító spekulálni, hogy csak a CD14-et expresszáló sejtek alkalmazhatják ezt az egylépéses választ az LPS-re. Az emberi hagyományos monociták nagy mennyiségű CD14-et expresszálnak, de ha ezeket a sejteket GM-CSF / IL-4 vagy M-CSF jelenlétében tenyésztik, és ezekkel DC-kbe és makrofágokba történő differenciálódás indukálására szolgálnak, akkor a CD14 alacsony / neg ( Kiegészítő 8a. Ábra és az 54., 55. hivatkozás). Ez lehet az oka annak, hogy a makrofágok és a DC-k nem képesek aktiválni a Syk-et és mobilizálni a Ca 2+ -ot LPS expozíció során, és ezért nem szabadíthatják fel az IL-1α / β-t, ha nem adnak megfelelő gyulladáscsökkentő aktivátort, például ATP-t.

Egy korábbi tanulmányban arra a következtetésre jutottak, hogy az emberi vér monociták a kaszpáz-1 konstitutív aktiválódását mutatják, és ezért az LPS 56-ra adott válaszhoz nincs szükség további jelre. Éppen ellenkezőleg, itt arról számolunk be, hogy a kaszpáz-1 nem marad tisztázva a nyugvó monocitákban, és hogy a kaszpáz-5 expressziójának genetikai elnyomása rontotta az IL-1α és IL-1β LPS által indukált felszabadulását az NLRP3 gyulladásos folyamata által.

Not only are the cell types that employ this pathway distinct from one another, but also the mechanisms that generate the main products of this pathway, namely IL-1α and IL-1β. Previous data have already demonstrated that the mechanisms of IL-1α secretion and IL-1β release are distinct in murine cells 25 ; here we report for the first time that this dichotomy also applies to human monocytes. We observed that IL-1α/β pathway divergence occurs downstream of Syk, likely at the level of ROS production and Ca 2+ mobilization, since abrogation of the former impaired the secretion of IL-1β but not IL-1α. In contrast, inhibition of Ca 2+ mobilization down-regulated the secretion of both cytokines.

A final consideration is that while the one-step inflammasome pathway, in both mice and human monocytes, needs caspase-1 activation, it also exhibits important species-specific differences in its regulation. Human caspase-4/5 are already expressed in resting monocytes, macrophages and DCs, whereas murine caspase-11 is expressed only upon induction by type-I IFN 34, 35 . In contrast, human monocytes can activate caspase-5 in response to LPS and type-I IFN signalling was dispensable for enzyme activation.

In conclusion, our study describes a new molecular mechanism of IL-1α/β secretion that operates specifically in LPS-stimulated human monocytes with no requirement for additional external signals, leading to rapid monocyte activation and pro-inflammatory cytokine release. The identification of the molecular mechanisms that underpin this novel one-step activation pathway might provide new opportunities for therapeutic intervention in human inflammatory disorders.

Mód

Monocyte isolation and stimulation

Peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation of buffy coats obtained from anonymous blood donors (Blood Bank of National University Hospital, Singapore; NUS-IRB 12-044E). Monocytes were isolated by negative selection using Monocyte isolation Kit II (Miltenyi Biotech) following the manufacturer's instructions. Monocyte purity was assessed by flow cytometry using a PE-labelled anti-human CD14 antibody (clone 61D3, eBioscience) and was routinely >90%. Monocytes were cultured in plates of 96 wells (1.5 × 10 5 cells per well) or 24 wells (1 × 10 6 cells per well) in RPMI 1640-Glutamax medium supplemented with 3% human AB serum, 100 U ml −1 penicillin, 100 μg ml −1 streptomycin, and 10 mM HEPES (all from Gibco). In some cases, monocytes were pretreated with the specific inhibitors (Z-YVAD-fmk (1–20 μM), LEVD-fmk (1–20 μM), diphenyleneiodonium (DPI, 10 μM) (all from Enzo Lifesciences), R406 (0.5–2 μM, Selleck), dynasore (40–80 μM, Sigma-Aldrich), IP3 receptor antagonist 2-APB (50–100 μM, Calbiochem) or LPS antagonist LPS-RS from Rhodobacter sphaeroides (10 μg ml −1 ) for 1 h before the addition of LPS ( Escherichia coli O55:B5, 10 ng ml −1 ). ATP (1 mM, Sigma-Aldrich) was added for the final 30 min of 5 h incubation with LPS. E. coli LPS-Re R515 and lipid A were used at 10 ng ml −1 .

For IFNAR neutralization, monocytes were pre-treated with a neutralizing antibody against human IFN-α/β receptor chain 2 (anti-hIFNAR, clone MMHAR-2, 5 μg ml −1, PBL InterferonSource) or its isotype control (mouse IgG2a, 5 μg ml −1, Biolegend) for 1 h before stimulation with LPS alone (10 ng ml −1 ), human recombinant IFN-β alone (250 U ml −1, PBL InterferonSource) or a combination of the two for a total of 5 h duration.

Western blot

Total cell lysates were prepared using Laemmli buffer containing 5% β-mercaptoethanol. Protein concentrations were determined using Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific). Proteins (20–50 μg) were boiled, separated on SDS–PAGE, and transferred onto PVDF membranes (Bio-Rad Laboratories). Membranes were blocked with 5% non-fat dry milk in phosphate-buffered saline (PBS) with 0.1% Tween 20 (PBST, Sigma-Aldrich) for 1 h at room temperature, and incubated overnight at 4 °C with the following primary antibodies diluted 1:1, 000 in 5% BSA/PBST; anti-NLRP3 (#AG-20B-0014-C100, Adipogen), anti-IL-1β (#2022), anti-total Syk (#2712), anti-caspase-1 (#4199), anti-caspase-5 (#4429), anti-caspase-4 (#4450) (all from Cell Signaling) and anti-GAPDH (#MAB374, Millipore). For phospho-Syk detection, membranes were blocked and incubated with the primary antibody (#2710S, Cell Signaling) in 5% BSA in Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20 (TBST). Densitometry analysis was performed using ImageJ software and the data were normalized against GAPDH. Images have been cropped for presentation. Full-size blot images shown in Figs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and Supplementary Figs 1, 5, 8 and 9 are included in Supplementary Fig. 11.

Citokin mérések

Human IL-1β and IL-6 (both from Biolegend), as well as IL-1α (R&D Systems), were measured in cell-free supernatants by ELISA.

Valós idejű kvantitatív PCR

RNA was isolated using the RNeasy method (Qiagen) and treated with DNAse I (Promega). Quantitative real-time PCR was performed in triplicate using Go Taq qPCR Master Mix (Promega) with the following validated SYBR Green primer pairs: ISG54 forward 5′-GGAGGGAGAAAACTCCTTGGA-3′, reverse 5′-GGCCAGTAGGTTGCACATTGT-3′; ISG56 forward 5′-TCAGGTCAAGGATAGTCTGGAG-3′, reverse 5′-AGGTTGTGTATTCCCACACTGTA-3′; CASP1 forward 5′-GGAAACAAAAGTCGGCAGAG-3′, reverse 5′-ACGCTGTACCCCAGATTTTG-3′ 57 ; CASP4 forward 5′-AAGAGAAGCAACGTATGGCAGGAC-3′, reverse 5′-GGACAAAGCTTGAGGGCATCTGTA-3′; CASP5 forward 5′-GGTGAAAAACATGGGGAACTC-3′, reverse 5′-TGAAGAACAGAAAGCAATGAAGT-3′; NLRP3 forward 5′-TGGCTGTAACATTCGGAGATTG-3′, reverse 5′-GAAGTCACCGAGGGCGTTGT-3′; GAPDH forward 5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′, reverse 5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′. Amplification was performed using a 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems) and the relative expression level of each gene was evaluated using the 2 −ΔCt or 2 −ΔΔCt methods, as indicated. Values are normalized for the expression of the housekeeping gene (GAPDH) and the Ct value of untreated (UT) or control (CTRL) siRNA was used as a calibrator.

Small interfering RNA-mediated knockdown

Monocytes (5–10 × 10 6 ) were nucleofected with 300 nM siRNA according to the manufacturer's instruction (Amaxa Nucleofector Technology, program Y001). Transfected monocytes were incubated for 36 h with 20 ng ml −1 IFN-γ and then stimulated with LPS alone (10 ng ml −1 for 8 h). The following validated siRNAs were used: NLRP3, 5′-ACCGCGGUGUACGUCUUCUUCCUUU-3′ 58 (AITbiotech); CASP5, 5′-AUAGAACGAGCAACCUUGACAA-3′ and 5′-CUACACUGUGGUUGACGAAAA-3′ (AITbiotech); CASP4, ON-TARGETplus SMART POOL Human Casp4 SiRNA (L-004404-00-0005, Dharmacon): 5′-CUACACUGUGGUUGACGAA-3′, 5′-CCAUAGAACGAGCAACCUU-3′, 5′-CAGCAGAAUCUACAAAUAU-3′, 5′-CGGAUGUGCUGCUUUAUGA-3′.

ROS measurement

Monocytes were seeded into black 96-well plates (1.5 × 10 6 cells per well) and rested for ≥2 h. The Syk inhibitor R406 (0.5–2 μM) or vehicle control DMSO was added 30 min before LPS stimulation. The cell-permeable probe H2DCF-DA (10 μM, Enzo Lifesciences) was immediately added and fluorescence was measured every 10 min using a microplate fluorimeter (TECAN; excitation, 480 nm; emission, 530 nm). For each condition, values in triplicate were normalized to the average reading of the untreated control.

Calcium mobilization assay

Cells were plated into black 96-well plates (1.5 × 10 5 cells per well) and rested overnight at 37 °C. Cells were incubated for 45 min in the dark with 100 μl of Hanks' balanced salt solution (HBSS) containing HEPES, probenecid (2.5 mM) and Fluo4-NW (20 mM, Invitrogen). In some experiments, cells were pre-incubated with R406 (0.5 μM) or U73122 (3 μM) for 1 h before addition of Fluo4-NW. Fluorescence was monitored before and after the injection of HBSS, LPS (1 μg ml −1 ) or ATP (1 mM) using a Victor4 plate reader (Perkin Elmer; excitation, 485 nm; emission, 535 nm). All experiments were performed at 37 °C. Fluorescence (F) was normalized against the baseline acquired at the time of the stimulation (F0).

Monocyte-derived DCs and macrophages culture

Monocytes (>95% pure) were positively selected using the CD14 + monocyte isolation kit (Miltenyi Biotec) and then transferred into 6-well plates (2 × 10 6 cells per well) in RPMI 1640-Glutamax medium, supplemented with 10% FBS, 100 U ml −1 penicillin, 100 mg ml −1 streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, and MEM non-essential amino acids (MEM-NEA) (all from Gibco). DCs were generated by culturing monocytes with recombinant human GM-CSF (50 ng ml −1, Miltenyi Biotec) and IL-4 (10 ng ml −1, R&D Systems), while macrophages were differentiated with recombinant human M-CSF (10 ng ml −1, R&D Systems). On day 3, the cytokine-supplemented medium was refreshed. On day 7, DCs and macrophages were plated into fresh plates of 96 wells (1.5 × 10 5 per well) or 24 wells (1 × 10 6 cells per well) in complete medium and stimulated for 5 h with 1 μg ml −1 E. coli -derived LPS (serotype O55:B5) either alone or in combination with 1 mM ATP added to the culture for the last 30 min.

Cell death measurement

Lactate dehydrogenase (LDH) was measure in cell-free supernatants following the manufacturer's instruction (Promega). For the Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-ADD) staining, monocytes were treated with LPS (10 ng ml −1 ) for the indicated time and subsequently stained using APC-conjugated Annexin V and 7-AAD (both from BD Pharmingen) according to the manufacturer's protocol. Data were acquired on a LSR II flow cytometer (BD Biosciences) for analysis using FlowJo software (TreeStar).

Immunfluoreszcencia és konfokális mikroszkópia

Monocytes were plated in μ-Slides (Ibidi) and stimulated with LPS (10 ng ml −1, Enzo Lifesciences) or with biotinylated LPS (10 μg ml −1, Invivogen) for the indicated times. Where indicated, R406 (2 μM) or dynasore (40 μM) were added 30 min before stimulation with LPS. Cells were fixed in 2% paraformaldehyde (Polysciences) for 10 min at room temperature and then permeabilized with saponin (0.1% in PBS, 0.2% gelatin and 5 mg ml −1 BSA). Cells were stained with CD14-FITC (BD Biosciences), Rab5 and LAMP-1 (both from Cell Signaling), together with DAPI, and imaged on a FV1000 Olympus confocal microscope using a × 100 objective with an additional zoom of 2. Colocalization was quantified using the Pearson's correlation coefficient calculated by Imaris (Bitplane).

LPS internalization assay

Monocytes were stimulated with biotinylated LPS (10 μg ml −1, Invivogen) for the indicated times. Membrane-bound LPS was detected by incubation with AlexaFluor 450-conjugated streptavidin (1:200, eBioscience). After staining, cells were rinsed extensively with PBS to remove excess streptavidin, and then fixed and permeabilized with BD Cytofix/Cytoperm buffer. Intracellular LPS was stained using APC-conjugated streptavidin (1:200, eBioscience) and data were acquired on a LSR II flow cytometer (BD Biosciences) for analysis using FlowJo software (TreeStar).

Mass spectrometry analysis

To identify caspase-5 cleavage sites prior trypsin digestion, recombinant caspase-5 was labelled for 1 h with Tandem Mass Tags (TMT, Pierce) in order to modify primary free amines (N-terminal) as previously described 59 . Labelling reaction was quenched with 1 M Tris HCl pH 7.4 (15 min, RT) followed by protein denaturation in 50% trifluoroethanol (TFE), 50 mM triethylammoniumbicarbonate (TEAB) pH 8.5. Reduction was done with 20 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) (20 min, 55 °C) and alkylation with 55 mM chloroacetaldehyde (CAA; 20 min, RT) followed by trypsin digestion (18 h, 37 °C) and subsequent acidification with 1% trifluoroacetic acid (TFA). Following desalting on STAGEtips 60 peptides were separated and analysed by reverse phase liquid chromatography (RP-LC) on Dionex 3000 HPLC system (Thermo Scientific) coupled with Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Scientific) in a 100 min gradient of solvent A (0.5% CH3COOH in water) and solvent B (80% MeCN, 0.5% CH3COOH in water). Raw spectra were processed by Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific). Obtained peak list files (.mgf) were searched using Mascot 2.5.1 (Matrix-Science) with Uniprot Human database using semi-tryptic or unspecific cleavage with the following parameters: fixed modification, carbamidomethyl cysteine; variable modifications, oxidation on methionine; acetylated N-terminal protein, TMT label or dimethyl labelling. Since TMT blocks also lysine residues cleavage we used 4 missed cleavages option, MS accuracy 20 ppm, MS/MS accuracy 0.03 Da.

Statisztikai analízis

Data were analysed using Prism 6 software (GraphPad) and statistical significance was determined using the one-sample t -test.

További információ

How to cite this article: Viganò, E. et al . Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step non-canonical inflammasome activation in monocytes. Nat. Commun. 6:8761 doi: 10.1038/ncomms9761 (2015).

Kiegészítő információk

PDF fájlok

  1. 1.

    Kiegészítő információk

    Supplementary Figures 1-11

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával vállalja, hogy betartja feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha valami visszaélésszerűt talál, vagy amely nem felel meg a feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg, hogy nem megfelelő.